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标题: 机械法传代如何更好的将干细胞团块弄碎 [打印本页]

作者: 随风的天使 时间: 2009-8-2 20:57 标题: 机械法传代如何更好的将干细胞团块弄碎

我做的是牛的胚胎干细胞，我采用机械法传代，但总是团块很大，请问各位高手机械法传代如何更好的将干细胞团块弄碎？

作者: zpzp0312 时间: 2009-8-3 08:52

楼主是传代？4 s5 k( [$ d" p# _
还是分离？
按说传代时没有必要用机械法了，酶消化完全可以啊！
即使是人的ES细胞

作者: 随风的天使 时间: 2009-8-3 22:14

是的，在小鼠和人上干细胞传代都是用胰酶消化的，但是牛这种大的动物比较特殊，用胰酶消化容易分化，所以尽量采用机械法分离和传代。我曾经试着用胰酶消化传代过，效果不好，所以现在总是机械法传代，但是感觉块太大了。不知道有没有好的办法弄得块小点。

作者: zpzp0312 时间: 2009-8-4 10:33

是不是可以考虑将克隆挑出后，使用微针将集落撕碎。
或者直接用刀片将集落划成小块再接种到新的培养体系中。% H2 z0 r d8 w" K: R; c: u) O
类似方法在人的胚胎干细胞传代中也常用到。
但现在看来人的胚胎干细胞完全可以使用酶来消化，并不会造成大范围的分化。" n+ J1 ~4 y( P8 t# d
因此，对于牛来说，或许培养体系还不完善，有待改进！
我想可以从信号通路寻找解决的方法，使用有关的化学试剂去避免分化，优化培养体系！4 s) } K4 Y0 R6 T+ O6 I
呵呵，这只是一个想法，如果真的实施起来，还是有很大难度的

作者: cortex 时间: 2009-8-4 14:53

用巴斯德管拉的针，在干细胞集落上划井字形，然后轻轻挑起，集落大小均匀。刚开始有点困难，不过，熟能生巧！
祝实验顺利！

作者: have-a-rest 时间: 2009-8-4 15:12

同意cortex的说法！
拉针很有技巧，拉熟了可以运用自如、出神入化，一般针越粗，挑的团块越大。5 R2 B) `( g( R+ K/ N
酶消化可以考虑dispase或胶原酶，胰酶也许不太适合！
都样上牛的胚胎干细胞了，真牛！

作者: jlhua 时间: 2009-8-5 09:58

thanks

作者: 随风的天使 时间: 2009-8-6 10:49

我每次传代时总是用口吸管的针将团块弄碎（团块大小不一），然后将团块传代，因为团块大小不一所以传代的克隆也是大大小小，总是出现不了在人和小鼠上那么漂亮的克隆。牛的培养液的确是没有很确定的体系，我现在也是在慢慢寻找合适的因子，保持它的未分化状态。如果用刀片切割是美容手术刀吗？非常感谢！

作者: 随风的天使 时间: 2009-8-6 10:51

非常感谢，我每次使用口吸管拉成很细的针，也许是我的技术问题，撕成的团块很不均匀。我试试您的办法！

作者: 随风的天使 时间: 2009-8-6 10:54

非常感谢！这几种酶文献中提到过，都有促分化的功能，我只做过用胰酶的，效果不好，还是只能是机械法传代。

作者: yaner 时间: 2009-8-12 15:04

可以用胶原酶IV短时间处理1-2min,再用拉的管划线传代

作者: xionghao508 时间: 2009-8-15 15:58

建议你去问问西北农业大学的窦忠英科研组，他们那都是做哺乳动物胚胎干细胞的好手

作者: kim22222 时间: 2009-8-17 08:20

谢谢

作者: 随风的天使 时间: 2009-8-24 12:04

12# xionghao508
" Q! w/ ]" r8 Q" F" d* N

好的，谢谢您

作者: 随风的天使 时间: 2009-8-24 12:04

11# yaner - J+ }2 n& u3 B

好的我回尝试，非常感谢

作者: 大漠 时间: 2009-8-25 23:45

可以考虑用胶原酶4消化，等克隆周边开始收缩后，用5毫升移液管吹或者刮下来。我想肯定可以。因为人胚胎干细胞用这种方法传代没得问题。

作者: 随风的天使 时间: 2009-8-29 20:05

其实在做的的时候将克隆弄起来挺容易的，就是克隆的团块很紧密，很难弄碎，我回尝试您的办法。谢谢

作者: maxiaorongqp 时间: 2009-8-30 01:44

实在分不开的时候我用两把显微镊，我觉得效果不错大家可以试试

作者: xionghao508 时间: 2009-8-30 11:12

注意用的器械要锋利，不然对干细胞伤害很大，易造成干细胞凋亡！

作者: 随风的天使 时间: 2009-9-1 11:52

18# maxiaorongqp 4 [1 C9 |! ~2 ~$ l7 x8 ~

8 u) B& C$ z4 u( g+ T- Y( B
谢谢，这个主意不错，我回尝试。

作者: 随风的天使 时间: 2009-9-1 11:52

19# xionghao508
1 {! P# Y" Y& a% c6 s. F. M
+ G" I* D4 |& u' B
非常感谢提醒

作者: lamprr 时间: 2009-11-22 15:56

楼主做的怎么样了？十分关心进展

作者: hesu1105 时间: 2012-3-6 11:01

各位都是用培养瓶培养的啊，但是对于贴壁培养的干细胞还是用平皿培养比较方便吧，用瓶子培养需要弯头吸管吹打的，而用平皿培养的话，就可以直接用一次性的移液管吹打操作，减少污染的可能吧。

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