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标题: MEF及饲养层的制备（实验记录） [打印本页]

作者: nculsa747 时间: 2010-11-25 13:46 标题: MEF及饲养层的制备（实验记录）

1.MEF的获取：（步骤4－12已经进行实践）" E6 F% m2 u1 S* k
（1）激素处理小鼠，同期发情和超数排卵: X8 T6 H7 ~& D' f, c
（2）2：1合笼过夜(雌：雄)3 d4 [9 n- f( {0 u9 y! o
（3）取出有阴道栓（即乳白色或淡黄色冻胶状物，确定其已经怀孕）的开始记时间为0.5天
（4）取出妊娠12.5-14.5天的小鼠为实验材料: V; l0 k8 {& X: f- H9 F. Z+ H; O' O
（5）颈椎脱臼法处死孕小鼠，放于盛有75%酒精的烧杯中消毒，拿到超净工作台上解剖，先剖开腹部皮肤，暴露子宫，然后换另外一套手术器械，用眼科镊提起近子宫颈端,分离子宫系膜,剪断子宫角，取出子宫，置于装有PBS的培养皿中。2 e/ s2 f( ^8 j' G2 c5 E; t
（6）取出胎鼠，在PBS中洗涤数次。去除头、尾、内脏和四肢，仅留躯干部。在PBS中充分漂洗，弃除红细胞。(用两个镊子配合即可除去羊水膜、胎盘、头尾、内脏、四肢)（若是想培养神经干细胞，则用剪刀剪取前脑进行培养即可）（可以一起处理多个胚胎）4 R* v+ d+ T* y: G1 _
（7）在新的培养皿中加入少量PBS，放入躯干部分，用眼科剪刀剪成1mm3以下的组织块碎片（可以剪的更碎一点，下步的消化时间就可以缩短）。( M" A2 @, C. ^6 o" ~& g" C- |# K& [% V
（8）加入2~4ml 0.25%胰蛋白酶，培养箱中消化10—15min，消化结束后加入等体积（多加点也行，只要不是少加，保证彻底的终止消化反应）的MEF Medium终止消化反应，轻轻吹打，使细胞分散。（做原代消化的时间稍长，胰酶用量也大，若是做传代，则只需加入500微升，最多1ml的胰酶，消化1~3min。）（躯干组织不易消化，做原代和传代时，故都用0.25%胰蛋白酶；而脑组织较易消化（脑肿瘤组织），原代和传代都用0.05%胰蛋白酶。）（消化可能不完全，也可室温静置5－10min，弃组织块，这样下面过滤就相对容易。）（如果消化得到的细胞太少，可以离心弃上清，PBS洗涤，重新加胰酶消化）（胰蛋白酶，Trypsin ,最适条件pH8.0，37度，溶液中钙镁离子和血清会降低其活力，故消化用的胰蛋白酶中加入了EDTA。消化结束时加入含血清的培养基即可终止反应） ; e1 ~! ?5 S9 T: ?
  （ 9）将收集的细胞悬液离心，1500rpm， 4min，弃上清，加入红细胞裂解液（3~5倍体积的细胞体积），轻轻吹打1min，离心除上清，若仍有红细胞残留，则须继续进行红细胞裂解步骤。
  （10）离心，弃上清，重悬细胞，过滤（200目筛网）并收集滤液，离心除去上清。, W5 {1 ~' S% g$ d# l
  （11）用MEF Medium洗涤沉淀，离心除上清，重悬细胞，铺板即可。置于37度5%CO2饱和湿度培养箱中培养。（一只老鼠会有多个胚胎，得到的单细胞，可铺到三个培养皿中或者更多的培养皿中进行培养）' Y" F1 r6 J+ |) c2 O2 D
（12）第二天换液，随后每2天换液一次。培养2～4d后，MEF接近汇合，即可按1:3比例传代培养。

要点: 无菌是操作关键, 动物皮毛不能直接或间接接触到子宫, 分离子宫时必须换用另一套无菌的眼科剪和眼科镊。培养同一株胚胎干细胞最好延用相同品系小鼠来源的成纤维细胞。! I/ `( I& o8 [: S: @6 _
要点: 仔细观察原代细胞有无被杂菌污染的迹象, 并且检测支原体, 确定无污染后传代扩增。
2.MEF传代（本步骤已经进行实践）; ]5 @' h7 q% O% W: ]; ^  x) {2 x
（1）消化：吸去培养皿中的MEF Medium，用PBS洗涤1次(加5ml)后，加入1ml 0.25%Trypsin/EDTA 37度消化1min（时间可以浮动，视消化效果定，在显微镜下观察, 当少量细胞漂浮, 贴壁的细胞层出现裂隙时，即可终止反应）。! F% l$ }) i4 w. Y
（注：加PBS洗涤，是为了除去血清，否则胰酶发挥不了作用）  G5 Y! V( F! x
（2）终止消化：加入5ml MEF Media终止消化（此时总体积为6ml），用吸管冲洗培养面并反复吹吸，使细胞离散成为单细胞悬液。(离心步骤省略：将细胞悬液移入离心管，1500rpm×4min。弃去上清液，用MEF Media重悬MEF成单细胞悬液。)- o: Y1 x+ e6 z6 h( U8 K$ h8 p
（3）分装接种：吸取2ml细胞悬液到新的培养皿中（其中已经加了8ml培养基），再取2ml单细胞悬液加到另外一个新的培养皿中（其中已经加了8ml培养基），此时原来的培养皿中还剩余2ml，吸取8ml培养基加入其中，轻摇，37度5%CO2饱和湿度的培养箱中培养。（1传3，其中2个是新的培养皿，1个是旧的（原先的），多省啊！ 100mm的培养皿，通常加10ml培养基）
（4）隔一天，视生长状况传代。# _4 N3 E* P/ r9 o+ S

注意: 每次传代尽量把成纤维细胞消化、吹打成单细胞悬液.! f' V# [- S0 W) l3 r3 b

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3.冻存MEF（本步骤已经进行实践）; G9 ^. a+ ~  ]) ^1 J( H

在P2传P3代时，取三分之一的dishes继续进行MEF传代操作，另外三分之二进行冻存处理（本实验中P2有27个dishes，其中8个继续做传代，成24个dishes；另外19个做冻存处理，每个dish冻存一管）。
（1）取出19 dishes，吸弃media，加PBS洗一次（5ml）。+ B1 T7 k0 m, ^& y. d  F& I- Y( Q
（2）加1ml trypsin下消化1分钟，加2ml media 终止消化，轻轻吹打下细胞并分散均匀，收集细胞悬液到15ml离心管中（本次三个dishes收集到一个15ml离心管中），再加1mlPBS冲洗dish，并转移到离心管中。& S% b4 f9 |2 H& N6 _9 X
（3）封口膜封口，放在离心机里，1500rpm，4度，4min，离心。与此同时，配制冻存液。取出DMSO（二甲基亚砜，作冻存剂。本实验室的DMSO是常温下保存在抽屉里的。瓶子是深色的。），喷撒酒精消毒，放在实验台上。取两支15ml的离心管，每管加9mlmedia，然后每管再加1ml DMSO，混匀。
（4）取出离心机里的离心管，喷撒酒精消毒，放在实验台上。取一管，倾倒去上清，加入3ml冻存液（因为要分装到3个冻存管中。冻存管总容量是2ml，最大刻度是1.8，本实验室通常加1ml冻存液进行保存），轻轻吹打几下，混匀细胞。取1ml，加入到冻存管中，放入冻存盒里（使用的是异丙醇冻存盒。异丙醇在冷冻细胞的过程中可以辅助实现缓慢降温，直接从室温放进-80可以达到近似于1度/分钟。异丙醇冻存盒在用之前要室温放置一段时间，让其达到室温后再用）。然后再对下一管进行操作。（应尽量避免细胞在常温下与DMSO的接触时间）
（5）把冻存盒放在－80度冰箱里过夜，第二天拿到液氮中冻存。（由于液氮罐已满，所以保存暂时保存在－80度冰箱里）
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   问题：一dishes太多，在消化操作时一定要快，否则第一个dish可能消化时间较长，影响细胞状态。
         二加1ml PBS收取余下细胞时会，由于量太少易产生很多气泡，下次要增加量到2ml 。
         三冻存液使用的是MEF media + 10%DMSO，这样FBS含量少，对细胞状态产生影响，下次要增加FBS的含量（适当增加FBS的量有利于提高复苏时细胞的成活率）。（MEF media由DMEM 11965 +10%FBS+1%P/S）
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4. mitomycin C处理MEF，并冻存（本步骤已经通过实践）
（1）当P3代MEF生长接近汇合时，吸去原培养基，用PBS洗2次（每次5ml），然后加入4ml 10μg/ml的mitomycin C处理MEF细胞，置于培养箱内2h。/ z; t9 B; a+ u8 u
（2）弃去mitomycin C，用PBS洗涤2次（每次5ml）。
（3）加0.25％Trypsin  1ml消化1-3分钟，用2 ml MEF Media终止反应。轻轻吹打下细胞，并把悬液转移到15ml离心管中，用2ml PBS 洗涤，收集余下的细胞。（两个dishes的细胞转移至一个离心管中，总体积为5ml*2）
（4）1500rpm, 4度，4min，离心。与此同时配制冻存液（20ml MEF media + 2.5ml FBS + 2.5ml DMSO）。（此处相对3中冻存液，提高了FBS的含量，以期维持更好的细胞状态）; S$ V$ {3 {9 R6 ?& J0 r+ `: O5 j
（5）倾倒去上清，加2ml 冻存液重悬，分装到2个冻存管中，每管1 ml。标注信息。置于异丙醇冷冻盒中，放入－80度冰箱中过夜，第二天转移到液氮罐中保存。

注：上面用的mytomicin C 可以用MEF media (DMEM应该以可以吧)配制，也可以用无菌的PBS配制。（Mytomicin C是针剂瓶装的，10mg/支，可以采用无菌PBS溶解，配制成1mg/ml，装在15ml离心管中，锡纸包裹（需要避光），4度保存即可。用时再配制成工作浓度；若是用MEF media配制，可以直接配制成工作浓度，用时直接取用。最好买sigma的。）注意丝裂霉素C 的有效期和使用方法。若发现分装的丝裂霉素C 溶液析出结晶或溶液由浅蓝色转变成紫红色时, 说明丝裂霉素C已经失效, 不能再使用。
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5.复苏（本步骤已经通过实践）6 }$ r+ T  i4 g  D7 i1 A
（1）取出冻存管，在37度水浴中迅速融化（1－2min），当有少量冰块剩余时取出，用吸水纸拭干水，用75%酒精喷一下。（剩少量冰块与完全融化，效果差别不大。也可完全融化）
（2）用移液枪把冻存液转移至已加有5mlMEF Media的15ml离心管中1000转，4度，4min，离心。1 K: t+ P. N; i4 {: T7 L$ u
（3）2ml MEF Media 重悬，转移至加有8ml MEF Media的100mm培养皿中，于37度5%CO2饱和湿度培养箱中培养。

作者: nculsa747 时间: 2010-11-25 13:46

请求加精！！！

作者: 懵懂干细胞 时间: 2010-11-25 14:41

回复 2# nculsa747
加为精华你向海洋大哥申请！呵呵！我给你加分！！谢谢分享！！！

作者: treestem 时间: 2010-11-25 15:23

回复 3# 懵懂干细胞 [/
% d6 F6 }6 u- J) |; E怎样的feeder是好的?楼主一般用什么方法来判定呢？处理后feeder在形态上有明显变化吗？
作者: CQ熊猫猫 时间: 2010-11-25 16:21

回复 1# nculsa747 ; Q' }" V2 ]. W
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+ A$ ]- K) j' Q7 O+ Y+ z4 `- v    楼主你好，我想请问下关于丝裂霉素C处理成纤维细胞问题。. \3 F: O7 k& ^, T1 Y! }# o$ o
我现在的成纤维没用丝裂霉素C处理，成纤维长得飞快，而iPS细胞长得很慢，估计是营养跟不上还是其他的啦？因为师兄买的丝裂霉素C是国产的，有效期只有3个月吧，已经过期了，所以才没用的。
; g5 d2 q, s/ E. A( E 所以我想问一下，如果我用丝裂霉素C处理成纤维的话，可以复苏后再处理吗？因为冻之前处理的话，我害怕复苏效果不好。但是如果复苏后处理，丝裂霉素C有效期又要必须长才行，纠结啊......
+ V' W/ ]' ]+ H0 r. x3 H    还有就是，我用六孔板养的细胞，一次加多少丝裂霉素C工作液啊？
$ ^# _" f7 v. x" d' S5 }6 `, X6 E 科研计费不多，所以想丝裂霉素C这些试剂都只能买国产的，惨啊！！！0 ~6 `5 s  M; M  H
非常感谢
作者: nculsa747 时间: 2010-11-25 21:49

回复 5# CQ熊猫猫
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首先，你要搞清楚一个问题，iPS和ES是要在Feeder上才能很好的生长的（悬浮培养暂且不说）。为什么用Feeder呢，因为它不能够分裂，但可以分泌一些生长因子之类的东西供iPS\ES生长。你没有用MMC处理MEF，就用其培养iPS，你的iPS如果能长起来就怪了！! A$ U# Y4 Y6 {( h" h) V  O
可以在复苏后用MMC处理MEF，冻存前处理MEF，复苏时会有一部分死亡，可以适当增加铺板密度。我们通常一次处理很多MEF成Feeder，然后计数，冻存，用时复苏即可。如果你想复苏后再处理，当然也是可以的。9 @/ h) S- K; \! C- [- t; O
你经费有限，还用六孔板养MEF，看来你们还是有钱。一般养在100mm 培养皿中就行了（corning的就很好）。100mm dish加3－4mlMMC即可。六孔板，每孔加500微升到1毫升应该是够了。; F7 u% G* J6 k9 t. m; y
祝你好运！
作者: nculsa747 时间: 2010-11-25 21:54

回复 4# treestem
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我们通常前一天复苏feeder，第二天用它来接种ESC。标准是：密度要适中，过密细胞不易贴壁，过疏细胞易分化。feeder的状态好坏，讲不太清楚，凭个人经验。mef 与feeder形态应该没有多大差别，只是后者不能够分裂而矣。
作者: CQ熊猫猫 时间: 2010-11-26 00:36

回复 6# nculsa747 + E8 n$ @# G! J, r! V3 ?0 M
! r- a2 p7 N! E6 n: s
8 i$ h& S$ t5 D* J, W* W; \2 O0 a
谢谢你的建议，其实我不是诱导iPS细胞，我是买的iPS细胞株，向心肌细胞分化！# {$ Q3 j9 J0 z' }6 ^3 J: b3 W4 w
  之前我师兄真的没用丝裂霉素C处理，就直接把iPS细胞种在成纤维上面，传代后，差贴下来的成纤维又会长出iPS团来。但是我还是想处理下成纤维细胞，这样iPS细胞也许会长得快些。
, t. ^2 G, X4 `9 s% X  制作成纤维的时候，我是用的10cm的大培养皿，冻之前改培养在6孔板的，方便以后复苏iPS细胞，因为iPS细胞不能大规模的培养，所以才用的6孔板" e, c6 t2 a* r9 W3 f9 d; O
  请问国产的丝裂霉素C那个公司的比较好，有效期比较长，呵呵！谢谢了
作者: deron 时间: 2010-11-26 13:15

感谢楼主的精彩实验笔记，一直想了解关于MEF的具体步骤。
作者: nculsa747 时间: 2010-11-26 13:36

回复 8# CQ熊猫猫
  t1 U1 i( Z* T) e, t- I7 n- v, _: B' M. M' l6 r* D7 [! P& K
1 V6 D" y) S9 f" R  q1 O( E
抱歉哈，我没有养过iPS，只是猜测既然它有干性，应该和干细胞有类似的特性。我不清楚国产的哪个公司的更好，还请其它战友帮忙回答一下。
作者: wuxiao101325 时间: 2010-11-26 13:58

好贴，我们最近也在做mef，步骤大同小异，我想请教楼主的是你们做丝裂霉素处理时做过预实验么？- k6 e3 w  r/ w
我们准备这样做，还请楼主及各位专家批评指正：7 y. P1 P9 P% \
因为不同小鼠品系（我们使用的是BaLbC小鼠）不同，我们认为丝裂霉素的处理时间也应该不一样，所以我们准备等mef长到第二代汇合度达到80~90%时用丝裂霉素分组处理，分为1小时、1.5小时、2小时、2.5小时实验组（时间为处理时间），处理后分别洗净消化并计数，按照50%汇合度的量接种，最后每天观察。
+ Z$ N* A# m# V' K预期结果：处理时间不够的肯定能继续繁殖，处理刚刚好的不能增殖，处理过度的话细胞死亡肯定较多（显微镜观察或计数可知），因此最终可以确定这个品系小鼠的合适的处理时间。6 A1 p' U6 {: Q* U  j+ L
实验结果我会及时跟进和大家讨论的！谢谢！
作者: manybit 时间: 2010-11-26 15:41

是那一种鼠
作者: nculsa747 时间: 2010-11-26 20:51

回复 11# wuxiao101325 [/b我]! u* C, m" S4 a+ C1 W
8 V2 V# R2 S' |. o; V
我们没有做过预实验。你的想法不错，可以试一下。不过你的方案还有待优化，因为预期结果可能并不见得如此明确。2.5小时的处理时间细胞应该不会死亡，因为我看到有人处理3小时。你的时间隔还应拉大0.5，1，2，3，5，8先进行粗筛，这样或许会更好些。结果有可能是这样的：在1-5之间，细胞不能够分裂，细胞状态良好；0-0.5细胞可以增殖；8-~细胞死亡，或是状态很差。另外，MMC一般都用10微克/毫升的浓度，你是不是也做一下其它浓度？呵呵，祝你成功！记得及时告诉大家结果。呵，我的MSN：zhugemengde@163.com
作者: nculsa747 时间: 2010-11-26 22:23

回复 12# manybit
+ B7 V# B3 Q8 F' w" D2 X0 R$ H, \# r9 j* k. n& U2 D: e7 a: B
" a; Q: Y9 c+ w. _3 c' r  n
ICR
作者: nculsa747 时间: 2010-11-26 22:26

回复 11# wuxiao101325
& ], L' {, T) o- `9 w" {# M
5 J# o  |7 d& n9 b/ P9 ~0 n9 k2 a+ _- y7 Q
我刚才问了一下实验室的其它人，他们说两个小时可能是经过摸索过的。具体过程不太清楚。呵呵
作者: bingliangai 时间: 2011-4-13 14:41

非常感谢分享
作者: wangyimei 时间: 2011-4-13 22:55

收获很大，感谢楼主的详细笔记
作者: 勺勺 时间: 2011-5-4 17:02

写的真好，学到很多。我做了几次MEF，总是冻存这关做不好，哎，学学大家的经验啊1
作者: 勺勺 时间: 2011-5-4 17:02

写的真好，学到很多。我做了几次MEF，总是冻存这关做不好，哎，学学大家的经验啊1
作者: 永远的伊凡 时间: 2011-6-18 10:54

谢谢楼主分享
作者: fan17930 时间: 2011-6-22 11:54

妊娠期一定要严格控制在 12.5-13d 之间。MEF的组织块可以不过滤一并接种。
作者: BenHantun 时间: 2011-12-14 20:34

收藏
作者: jjjk127 时间: 2012-1-7 19:15

楼主总结的真好，学习) M& |; h. [  G+ [1 P9 F

作者: 第一心音 时间: 2013-1-26 19:33

筛网在哪里买的啊？谢谢
作者: 细胞海洋 时间: 2013-1-26 22:30

回复第一心音的帖子
6 k1 @& ]1 B0 s8 h
9 O# S' T2 H( Y+ v$ y建议你发新帖提问
作者: dujuananlin 时间: 2013-1-26 23:41

谢谢分享！LZ真心很贴心呀. t+ U( R: x1 p5 ~5 Z& X

作者: 准姿梅影 时间: 2013-3-17 22:04

国产的丝裂霉素我用海正药业的，价格便宜，药店有售，避光保存，一次处理的细胞大概用3-5个月

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