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标题: 求助:鼠胚胎干细胞容易分化是怎么回事 [打印本页]

作者: wqcyqy0811 时间: 2011-6-1 09:54 标题: 求助:鼠胚胎干细胞容易分化是怎么回事

请大家帮忙分析一下：鼠胚胎干细胞生长第二天长的还可以，但到第三天就有许多死细胞飘起来，细胞状态也不好，轮廓不清楚，感觉是分化了？可能是什么原因？我的培养基是15% Hyclone 胎牛血清，1%P/S，1%NEAA，1%L-G，1‰β巯基乙醇，高糖DMEM培养基，10ng/ml LIF.

作者: 王乾 时间: 2011-6-1 10:59

不知道你的MEF怎么样，MEF对ES的状态影响是非常大的

作者: xiaoyurly 时间: 2011-6-1 11:06

血清对ES的分化也有一定刺激作用，我们用12% FBS的培养基，不知你们以前培养的怎么样？

作者: wqcyqy0811 时间: 2011-6-1 12:08

我以前养的可以，MEF细胞密度能达到90%。不知道为什么

作者: dilal 时间: 2011-6-1 12:47

问一下你用的hyclone血清是什么货号，如果不是ES专用的，不同批次的血清对mESC的增殖和分化影响不同。我们最近用gibco的血清也出现了ESC状态不好的现象，考虑跟血清批次有关，打算重新换血清。

作者: genedu 时间: 2011-6-1 12:52

不是培养体系的问题

作者: 干细胞狂想 时间: 2011-6-1 13:34

换成10%FBS，低糖DMEM。

作者: 干细胞狂想 时间: 2011-6-1 13:35

还有，大家有时提的这个问题，我发现文献看得有点少啊，很多高分文献都标注的很清楚，大家可以去搜来参考。

作者: llecstem 时间: 2011-8-14 12:47

我们培养ES用的gibco的knock-out SR，是一种血清的替代物

作者: starlight 时间: 2011-8-15 10:27

干细胞状态，饲养层状态是最主要的，

作者: chliu 时间: 2011-8-17 18:55

一种可能是细胞本身不好，有分化倾向 w- ?- Q8 F* ]$ n. C' i
另一方面，饲养层要分布均匀，状态好，铺满，最好多一些，密一些。

作者: yangpan521 时间: 2011-8-22 11:46

回复干细胞狂想的帖子
7 ~# P4 C, p1 B: G D; f
文献只是参考而已，但实际还要看细胞的状态，我们实验室养小鼠的胚胎干细胞就用，DMEM + 2mM 谷氨酰胺 (Gibco) + 2mM丙酮酸钠（Gibco) + 1%非必须氨基酸(Gibco) + 0.1 mM β-巯基乙醇+ 1000U/mL LIF (ESGRO, Chemicon International) + 10% FBS（Hyclone澳大利亚原装进口，Cat No. SH30084.03) + 1%青链霉素 (Gibco)。效果很好，但用KSR却不能达到相应的效果。

作者: hibino 时间: 2011-8-24 18:23

1. 不要用血清，用KSR 或者N2+B27（GIBCO）。因为血清的批次之间有差异的
2. 不同细胞系的培养条件不一样的，如E14可以用LIF培养，B6必须用LIF加CHIR99021.请告知您的ES的品系
3.L-G 请换为gulamax（GIBCO），稳定性极佳也不贵。我吃过L-G的亏浪费了整整半年时间，L-G最好是现用现配，4度时降解速度是按天算的。- C: Z2 o% x. _$ `
其他楼下补充

作者: meiying3061 时间: 2011-9-5 16:47

干细胞的状态饲养层是最重要的，密度不能希也不能过密；
此外传代时间也很重要，我一般隔2天传代一次，如果再多长一天就会出现楼主说的情况；
我的培养体系用的是15%的gibco 的ES级胎牛，GIBCO的ko-dmem，其他都差不多，总之血清也很重要

作者: yaner 时间: 2011-9-20 17:08

传代时接种希一些试试

作者: lhw7514093 时间: 2011-10-12 13:43

一般在48小时内就要传代的，培养时间过长而不传代很可能会分化

作者: zhusealin 时间: 2011-10-13 11:44

跟血清和饲养层状态有关，血清要用ES级别的

作者: sarah19860420 时间: 2011-11-22 23:54

通过最近看论坛里的帖子，觉得楼主最有可能存在的问题就是血清和饲养层了。

作者: sarah19860420 时间: 2011-11-22 23:55

我们这里培养胚胎干细胞以及IPS是选择用血清替代物的。其他的使用血清

作者: yangpan521 时间: 2011-11-23 09:23

昨天师兄给我看了一下小鼠胚胎干细胞R1也出现了类似的情况，初步怀疑可能是饲养层的问题，它使用的是20%的血清，其他因子和大家的一样，还有完全照搬文献所说做法的来养细胞是行不通的，要根据自己实验室的情况（有的实验室各方面都达到一流，有的连最起码的层流都谈不上）来选择合适的培养基，但最根本的原则还是要保证细胞的状态要好。

作者: majing217 时间: 2011-11-23 10:24

用低糖的DMEM的，饲养层的质量也很重要。

作者: friendly0722 时间: 2011-11-28 15:02

好像文章上所提到的es培养体系都是15%fbs或者15%ksr吧

作者: jjjk127 时间: 2011-12-7 14:14

我们用的是gibco的knockout DMEM 和ES-FBS,如果mef状态好的话，mESC长的还是很好的

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