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标题: 扩增质粒时的摇菌问题 [打印本页]

作者: pla269 时间: 2011-7-9 22:15 标题: 扩增质粒时的摇菌问题

大家在扩增质粒（大提）的过程中，为了提高得率，摇菌时一般有什么具体办法？先用15ml离心管摇菌时用多少LB培养基，多少菌，摇多长时间？然后往大瓶里放多少菌，摇多长时间？大家指教一下

作者: Temin 时间: 2011-7-9 22:39

我们喜欢用可以透气的摇菌管，有种BD的大概15ML的管子，具体货号不记得，它能透气，让E.coli长的密度高一些。加入的LB在5ML左右就可以。你说大抽的话，我建议用50ML管子菌液会多些，可以摇菌20ML。也可以用透气瓶盖的三角瓶，可以摇菌50ML-200ML不等，看你需要的量了。总之，我认为要得到多的质粒，就需要多的菌液，所以觉得透气培养比较好。至于接种密度和摇菌时间，我们一般按照1/20左右接菌，就是500UL接菌10ML LB培养基，摇菌过夜（16小时左右）。希望能对你有所参考作用。

作者: lemma710 时间: 2011-7-9 23:47

大抽的话我一般都用大的锥形瓶的，瓶口用纱布封紧。摇菌最好不要超过16h，过了菌会老。加菌我按1:1000加，1ML+1UL的菌。大抽质粒太多了也不一定好，它柱子都是有一定的吸附能力的，而且裂解的时候菌太多了会裂解不完全，这些都会影响抽出质粒的量的。试剂盒里应该有建议的菌的量的吧。

作者: pla269 时间: 2011-7-10 01:59

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有的技师说摇4-5小时就行了，不然死菌太多，菌的生长也受抑制了，也有人强调要过夜摇菌，你怎么判断菌量啊？

作者: 痞子的烟头 时间: 2011-7-10 08:06

正常是先挑菌落，于15或20的玻璃管内 5ml LB摇过夜，第二天，将5ML倒入250MLLB中，再摇过夜，基本上就可以了，提的量绝对够！注意均要加入抗生素，

作者: pla269 时间: 2011-7-10 08:26

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你是怎么判断菌量的

作者: Temin 时间: 2011-7-10 08:33

回复 pla269 的帖子3 C, M. n4 d5 Z8 k' r& F

我们正常的流程是：8 M8 c: o( i' z
第一天，下班之前也就是5点钟接菌，37度震荡培养；
第二天，上班的时候（9点钟）收菌，培养的时间也就是16小时左右。8 d: ?5 B3 a( o% g) @$ p5 f" O
基本上是目测判断菌量的多少，很久没有测定过菌液的OD值，我忘了是0.6-0.8还是多少，你可以自己查一查分子克隆手册。凭着经验，看起来比较浑浊就差不多了，因为我提取质粒一般是用作细胞转染，按照我们以往的实验，都是大致这样的流程，所以没有很细致的去研究这个。
摇菌4-5小时的话，在我们这边不大合适，因为这样接下来还得抽提质粒和验证质粒需要花费2-3小时，那样一个工作日就排满了，有可能做不完还得加班。
我觉得在基础实验这一块，尤其是商品化试剂盒非常成熟的基本实验技术，第一次第二次认真参考实验手册，这样你就会得到自己的判断，如果只是简单的得到质粒作为后续研究使用，你大可不必拘泥于实验手册，毕竟每种菌、每种质粒有自己的特性，怎么方便实验流程怎么来。

作者: jun8013 时间: 2011-7-10 08:50

回复 pla269 的帖子; P1 U3 w& }2 O5 z( B7 y& n
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测OD值，我们一般锥形瓶，100ml 1%接种量，你说的4-5小时应该是在对数期，OD应该在0.4-1.0之间，抽提质粒，我们一般是过夜培养12h即可，有时8-10小时。没有必要那么准确，主要是在你后面solution I II III与你菌体比例要做好，你的抽提试剂盒上应该有写

作者: susanliuxue 时间: 2011-7-11 07:22

为了提高得率，先用15ml离心管3mlLB培养基摇菌过夜，然后吸取100ul去大摇过夜。

作者: huangcong1988 时间: 2011-11-30 20:39

其实摇菌的多少，要看你所用的试剂盒，你如果是大提的话，一般必须得100ml LB以上，所以，你只能用锥形瓶；如果中提的话（50~100ml菌液就行），你还是得用锥形瓶，因为一般的离心管都盛不了那么多的LB，有人想用50ml离心管摇50ml菌，这个是很不可取的，因为50ml管虽然可以盛下55ml左右菌液，但是加了50ml lb后，瓶子里面就没什么空间了，这样很不利于菌的生长，另外，这样摇菌的话也摇得不均匀；如果是小提的话（10ml就够了），那么用50ml离心管就行了。菌液是否摇好主要看其浑浊程度，有些人说摇菌时间太长会长杂菌什么的，我暂时还没有过，不过我个人觉得摇菌最后就是直接摇菌过夜，摇完之后如果有事不能立即提，可以拿出来放4度，那样菌液还是可以保存一段时间的

作者: 懵懂干细胞 时间: 2011-11-30 21:15

回复痞子的烟头的帖子$ O7 W o+ j0 O, K N9 W8 P
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先在小管里面摇4-5小时在接大瓶的话是可以的！
提质粒的话可以摇菌多一点，看配液的浑浊度吧！
中间可以保菌一下！保菌的话为了保证菌的活力你可以离心收集一下再保！

作者: wangyashuai 时间: 2011-11-30 23:01

摇菌时间主要与你的抗生素有关，氨苄和卡那霉素因为细菌的分解机理不同，一个是吸收进菌体内部作用，可以多摇一下，一般不超过16个小时，另一个是细菌分泌蛋白到细胞外，外界抗生素浓度会很快下降，摇菌时间不能超过12小时，否则就可能长杂菌。

作者: lingling 时间: 2015-4-1 21:04

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你好，我想问下：“正常是先挑菌落，于15或20的玻璃管内 5ml LB摇过夜，第二天，将5ML倒入250MLLB中，再摇过夜”这里第二天你是把5mlLB倒入250MLLB中放4°C等下午5点再摇过夜吗？还是直接把已摇过夜5ml LB放在4°C下午5点再倒入250MLLB中，再摇过夜？

作者: 妖妖空 时间: 2015-4-1 22:41

培养一般都是12hr的，我们都是1:100接菌的，有时候需要考虑质粒的类型的，高拷贝还是低拷贝。低拷贝的有专门的处理方法。

作者: 细胞海洋 时间: 2015-4-2 07:48

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作者: lingling 时间: 2015-4-2 08:13

谢谢

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