扩增质粒时的摇菌问题

pla269

大家在扩增质粒（大提）的过程中，为了提高得率，摇菌时一般有什么具体办法？先用15ml离心管摇菌时用多少LB培养基，多少菌，摇多长时间？然后往大瓶里放多少菌，摇多长时间？大家指教一下

lingling

谢谢

细胞海洋

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妖妖空

培养一般都是12hr的，我们都是1:100接菌的，有时候需要考虑质粒的类型的，高拷贝还是低拷贝。低拷贝的有专门的处理方法。

lingling

回复 痞子的烟头 的帖子! }" D, g+ k/ ]& y! l

2 N* k* s: p+ v! V' \$ E+ d你好，我想问下：“正常是先挑菌落，于15或20的玻璃管内 5ml LB摇过夜，第二天，将5ML倒入250MLLB中，再摇过夜”这里第二天你是把5mlLB倒入250MLLB中放4°C等下午5点再摇过夜吗？还是直接把已摇过夜5ml LB放在4°C下午5点再倒入250MLLB中，再摇过夜？

wangyashuai

摇菌时间主要与你的抗生素有关，氨苄和卡那霉素因为细菌的分解机理不同，一个是吸收进菌体内部作用，可以多摇一下，一般不超过16个小时，另一个是细菌分泌蛋白到细胞外，外界抗生素浓度会很快下降，摇菌时间不能超过12小时，否则就可能长杂菌。

懵懂干细胞

回复 痞子的烟头 的帖子* s9 M# m, f, y- Y2 U' t" J/ |
) N. T( C- U1 a' S5 l5 T
先在小管里面摇4-5小时在接大瓶的话是可以的！
$ H$ ?0 n! l; Z) p提质粒的话可以摇菌多一点，看配液的浑浊度吧！
8 Q, R  S2 b2 U% w( q1 N8 T中间可以保菌一下！保菌的话为了保证菌的活力你可以离心收集一下再保！

huangcong1988

其实摇菌的多少，要看你所用的试剂盒，你如果是大提的话，一般必须得100ml LB以上，所以，你只能用锥形瓶；如果中提的话（50~100ml菌液就行），你还是得用锥形瓶，因为一般的离心管都盛不了那么多的LB，有人想用50ml离心管摇50ml菌，这个是很不可取的，因为50ml管虽然可以盛下55ml左右菌液，但是加了50ml lb后，瓶子里面就没什么空间了，这样很不利于菌的生长，另外，这样摇菌的话也摇得不均匀；如果是小提的话（10ml就够了），那么用50ml离心管就行了。菌液是否摇好主要看其浑浊程度，有些人说摇菌时间太长会长杂菌什么的，我暂时还没有过，不过我个人觉得摇菌最后就是直接摇菌过夜，摇完之后如果有事不能立即提，可以拿出来放4度，那样菌液还是可以保存一段时间的

susanliuxue

为了提高得率，先用15ml离心管3mlLB培养基摇菌过夜，然后吸取100ul去大摇过夜。

jun8013

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5 P" R5 K1 z' Z  J4 y$ Y3 B
4 W0 Z7 ^0 S* K: q$ D测OD值，我们一般锥形瓶，100ml 1%接种量，你说的4-5小时应该是在对数期，OD应该在0.4-1.0之间，抽提质粒，我们一般是过夜培养12h即可，有时8-10小时。没有必要那么准确，主要是在你后面solution I II  III与你菌体比例要做好，你的抽提试剂盒上应该有写