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[请教] WB目的条带没出来 [复制链接]

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楼主
发表于 2014-4-30 22:52 |只看该作者 |倒序浏览 |打印
有没有哪位兄弟师妹做个collgen2和aggrecan的WB啊,actin出来了,但目的条带没出来。两个蛋白都是人髓核细胞来源的,分子量分别是142和75,一抗浓度都是1:100,能帮忙分析下原因吗
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沙发
发表于 2014-4-30 23:39 |只看该作者
本帖最后由 Tivah 于 2014-4-30 23:40 编辑 + b$ j8 C* \* b, f* N4 r

0 o! m: s7 `# u回复 Rainbow1989 的帖子
) i2 t/ r& a8 m
( }$ L/ j0 k- e5 u: X没做过这两个分子的。不过如果问题可能出在抗体上的话,你确定是1:100不是1:1000?这个浓度是说明书上的还是你实验室的经验用量?
* b1 ^. X* b; R  }2 p如果比例真是1:100,那你买的应该是国产抗体吧?你可以把公司和货号都写上来,看有没有人用过一样的。
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藤椅
发表于 2014-5-1 00:40 |只看该作者
转膜后用丽春红染色,看看你的目的蛋白的位置有没有条带;
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板凳
发表于 2014-5-1 09:04 |只看该作者
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Yet, if you were using antibodies in 1:100. I guess these antibodies are from domestic supplier. You better to check the quality by positive control first.
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报纸
发表于 2014-5-1 13:29 |只看该作者
我做过collgen2,组织用的肝脏,抗体用的sigma的大鼠抗体,但是浓度在1:1000就跑的很清晰了啊。如果楼主不清楚我可以发一张我跑的条带给你看下。
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地板
发表于 2014-5-1 14:20 |只看该作者
Rainbow1989 发表于 2014-4-30 22:52 / t0 [! t8 E: ?% ~
有没有哪位兄弟师妹做个collgen2和aggrecan的WB啊,actin出来了,但目的条带没出来。两个蛋白都是人髓核细胞 ...

: b6 I) q  u+ q6 G6 J( R8 r* x内参出来了,基本能证明你实验操作没有问题,并且细胞裂解和蛋白的释放没有问题;你需要考虑的问题是:
: C! {( v- A' Y4 r1. 一抗二抗的种属问题,这个别弄错了;4 k1 k: o5 g' b) F0 Q
2. 你的目的蛋白可能不如ACTIN 稳定,有可能降解,是细胞裂解后马上做的WB嘛,其次也要考虑跑胶 和 转膜的条件是否温和,防止蛋白降解。此外,你的目的蛋白比较大,转膜时间是否足够,如实在找不出原因,可以参考楼上的意见,转膜后做个立春红染色验证下。" q" R; F( o7 v) x% z- f$ [
3. 第三个蛋白的量是否足够,可能你的核细胞该蛋白表达很少!
$ A' d) `- [! J" l( t4. 条件允许做个阳性对照,验证抗体是否有问题
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发表于 2014-5-5 16:42 |只看该作者
放了个假,刚回来,谢谢各位兄台拔刀相助。确实觉得一抗的浓度有点大了,不过买来的抗体附带的说明书是这样要求的,下次1:1000试试看;另外蛋白浓度是6、7mg/ml,而且实验组包括阴性空白组(HADMSC)和诱导组(HADMSC-NPC),目的蛋白浓度肯定是会低些的,不知道这是不是也有很大原因。
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发表于 2014-5-5 16:46 |只看该作者
发错了,蛋白浓度是0.6、0.7mg/ml

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发表于 2014-5-5 16:49 |只看该作者
回复 aiver2001 的帖子
0 x" {# _) ]) z' U/ j  ]9 U$ l6 n! s0 W5 N% r* x5 `5 [
我们用的是abcam的抗体,抗体质量不会有问题吧,不过确实觉得一抗的浓度有点大了,但是买来的抗体附带的说明书是这样要求的,下次1:1000试试看,楼主能发条带来看看吗?谢谢

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发表于 2014-5-5 16:51 |只看该作者
回复 Andyhigh 的帖子
0 j, x" A5 P$ c4 A2 f( ?5 ^2 N) b2 V3 B4 z0 l
确实需要阳性对照,还有蛋白量的问题下次也要注意的,谢谢兄台
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