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作者：罗海龙 金玉玲作者单位：佳木斯大学神经病学研究所（黑龙江） 4 W% T2 W9 Z' K d2 `* x; J
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【摘要】 目的 研究胰岛素样生长因子-1（IGF-1）与不同浓度的促红细胞生成素(EPO)作用对新生大鼠海马来源的神经干细胞向神经元方向分化的影响。方法 采用无血清培养基培养NSCs。实验分对照组、IGF-1组、不同浓度的EPO组及IGF-1、EPO联合组，将传3代的NSCs的分别加入各组中。诱导分化7天时，采用免疫细胞化学染色、检测NSE、GFAP的表达，观察NSCs分化状况,并作统计学分析。结果 与对照组相比，各组均能使NSCs向神经元方向分化的比率增加，其中，IGF-1 100 U/ml EOP联合组的NES阳性率最高、GFAP阳性率最低。IGF-1组与IGF-1 10 U/ml EOP组之间NSE阳性率和GFAP阳性率无统计学意义(P＞0.05)。结论 胰岛素样生长因子-1和不同浓度的EPO都促进NSCs向神经元分化，且在一定浓度范围内IGF-1和EPO具有协同效应。
- i5 ^ Y/ ^0 w7 A- h( f 【关键词】神经干细胞 胰岛素样生长因子-1 促红细胞生成素 分化
$ O3 q. `. i j+ B# } 神经干细胞因其在中枢神经系统疾病的治疗前景而倍受人们的重视。目前, 如何促进神经干细胞的增殖并诱导其分化是神经科学界研究的热点。既往研究大多观察单细胞因子对神经干细胞分化的影响， 而体内微环境中，神经干细胞分化会受到多源细胞因子的作用。本实验添加EGF和bFGF的无血清培养基中培养新生大鼠海马源性神经干细胞，观察IGF-1和EPO双因素对其分化的作用，为NSCs诱导分化调控机制提供新的实验依据。
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1材料和方法/ z' U) g% j" i, e4 q$ h9 x
8 R7 V5 ~- ^+ y 1.1材料
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实验动物为出生24小时之内的Wistar 大鼠（由佳木斯大学动物实验中心提供，动物质量合格证号：黑动字第99102001）主要试剂与仪器: DMEM/F12干粉培养基，B27添加剂，表皮生长因子，碱性成纤维细胞生长因子，胰岛素样生长因子-1，促红细胞生成素，抗大鼠Brdu兔抗大鼠巢蛋白单抗，羊抗兔IgG，兔抗大鼠NSE单抗，兔抗大鼠GFAP， SABC免疫组化试剂盒，DAB试剂盒，CO2恒温培养箱， XSZ-D型倒置生物显微镜，BIM-2000显微图像分析系统。& {; l3 |# ~1 I8 s/ l" z
! \7 R$ F1 v2 D" B: y# N7 y5 p" Q 1.2方法
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$ o" H8 L( e. A% P5 U) g! d 1.2.1神经干细胞的原代培养与传代培养及鉴定
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( S! V/ ^; N/ w& E2 B 取24 h内出生的Wistar大鼠，在无菌条件下取出海马。Hanks液漂洗，剪碎后反复吹打，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入完全NSCs培养液1 ml,吹打成细胞悬液，接种于细胞培养瓶中，放置37℃，5％CO2条件培养7天，传三代后备用。参考蔡文琴等方法［1］，经nestin和Brdu染色鉴定为NSCs［2］。7 {' u3 |) ?2 s7 s
/ B7 \* Y7 ^# Y& j% @4 X# A7 i, R 1.2.2IGF-1和EPO对大鼠Nscs分化的影响
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9 Q1 b% M. u; B7 W1 _, {4 w 将传3代的神经干细胞吹打为单细胞悬液,调整细胞密度为1105/ml,接种于预先置有涂布多聚赖氨酸盖玻片的6孔培养板中，贴壁培养2 d 后。撤除EGF和bFGF。根据培养液中的成分不同分为： A组基础培养液 10%胎牛血清。B组基础培养液 20 ng/ml IGF-1。C组基础培养液＋10 U/ml EPO。D组基础培养液＋100 U/ml EPO。E组基础培养液＋20 ng/ml IGF-1 10 U/ml EPO。F组基础培养液＋20 ng/ml IGF-1 100 U/ml EPO。置于37 ℃、5%二氧化碳培养箱中培养。
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! N8 x+ h2 A* }' @4 k' {# C) F 1.2.3免疫组织化学染色: k/ d4 N1 x( k1 X
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培养第7 d时, 应用免疫细胞化学染色检测特异性烯醇化酶（NSE）、胶质纤维酸蛋白（GFAP）。取出培养板，吸出培养液，PBS漂洗3次，4%多聚甲醛固定5～10 min， 3%H2O2作用10 min，滴加正常山羊血清，室温作用20 min，滴加兔抗大鼠NSE-1：400、兔抗大鼠GFAP-1：400。4 ℃孵育过夜，PBS漂洗3次，滴加山羊抗兔IgG，室温作用20 min，PBS漂洗3次，滴加SABC复合物，室温作用20 min，PBS漂洗4次，DAB 显色，脱水，封片，显微镜观察并照相。. T- h9 p/ R' K
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1.3数据分析及统计学处理5 X3 ~. ^- o4 ?" Y. l0 h
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免疫阳性细胞计数：采用网格计数法计数相同面积（40 mm2）计算NES和GFAP阳性细胞数和细胞总数。阳性细胞率（%）=阳性细胞数/细胞总数 100%。统计学处理采用SPSS 10.0软件。检测各组数据以（x±s）表示，多组比较用方差分析。# K$ H, ~( V6 H1 E$ Q$ T; u* ~
3 i" X/ U$ v1 H 2结果3 k/ @% q L1 h/ k
3 U( `. B; N- P 2.1神经干细胞的细胞形态的观察
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新生大鼠海马来源的神经干细胞刚接种后，在相差倒置显微镜下，可观察到绝大多数细胞为球状单细胞，悬浮生长。原代培养48～72小时，可见不规则及中等大小的圆形细胞集落形成。第4～5天，可见大量悬浮生长的球形细胞团，折光性好，少量的细胞贴壁生长。第7～9天时，细胞球明显增大，可见数百个细胞组成的细胞球，呈悬浮生长，形态规则，中心区细胞密度高，透光度差，无明显突起（见封四图1）。
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& ?: A0 q# B4 q; s 2.2神经干细胞的鉴定 3 G6 k( c" [! x& i# Y2 }- m4 e& b6 W
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经传3代培养的神经球，行Nestin免疫组织化学染色，结果显示绝大多数细胞呈nestin阳性（见封四图2）。传2代的神经干细胞经Brdu免疫荧光及组织化学染色，可见细胞呈 BrdU 阳性（胞核被染色，胞浆未被染色）（见封四图3），在荧光显微镜下，BrdU 阳性细胞的细胞核呈红色荧光（见封四图4），表明培养的细胞具有自身增殖能力。* m E' P/ ?8 \$ b% t# H r
( {$ o( Z/ G0 f 2.3神经干细胞分化的免疫组化观察结果8 y$ B" ]8 z4 }
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各组的神经干细胞均有一定比例的分化。7天后，取出盖玻片，细胞染色鉴定并计算 NSE、GFAP阳性细胞率(表1)。NSE 阳性细胞为棕黄色（见封四图5）GFAP阳性细胞（见封四图6）。统计学结果显示：各组NSE阳性率均明显高于对照组（26.25±2.31），差异有显著性（P＜0.05)。除IGF-1组与IGF-1与10 U/ml EPO组之间(P＞0.05)，各组之间统计学均有显著性差异。对照组的GFAP阳性率明显高于其他实验组，有显著性差异（P＜0.05）。IGF-1组与IGF-1与10 U/ml EOP组之间无统计学意义（P＞0.05）余组间统计学有显著性差异（P＜0.05）。表1不同培养条件对神经干细胞分化的影响（%）（略）注：*P＜0.05与对照组比较,#P＞0.05与IGF-1组比较。
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3讨论6 ~* `6 E: k: ^
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自上世纪90年代中期Davis等［3］确定神经干细胞的概念至今已有十年，人们逐渐认识到神经干细胞在神经科学发展中的重要位置。而神经干细胞的分化调控是研究中枢神经系统发育、损伤修复的细胞生物学基础， 是神经干细胞研究工作的重大问题及关键所在。6 M% F* Z* x u4 Q
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胰岛素样生长因子涉及神经细胞包括少突胶质细胞的增殖、生长、发育及促进髓鞘的修复及再生。本实验结果显示，IGF-1对神经干细胞分化的影响表明其显著促进神经干细胞向神经元方向分化，且IGF-1组神经元的形态发育完善，可见神经元的胞体更加丰满，胞体较大，其突起明显长于对照组。IGF-1对分化的影响似乎牵涉到特定的信号事件，其确切的机制仍在探讨之中。
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: K" t9 v, }, d) B8 X近年来的研究表明EPO作为一个内源性细胞因子以自分泌或旁分泌的方式发挥作用，在脑的发生发育过程中起调解和调控作用。而外源性EPO则能对离体培养的神经细胞起保护作用［6-7］。实验中我们发现，在与胎牛血清诱导分化的对照组相比，对照组向星形胶质细胞分化偏多，而EPO组向星形胶质细胞低于对照组，且向神经元方向分化的高于对照组。这样的结果表明，EPO促进体外培养的神经干细胞的增殖能力，并促其向神经元分化。本实验还显示无论 10 U/ml EPO组还是100 U/ml EPO组对神经干细胞的向神经元方向分化的能力均低于IGF-1。其二者对NSCs的作用强弱的机制有待进一步研究。* } ~' x8 U" S, a, R! L4 s: T
& `% A$ s0 p# H3 U; V4 q本实验中我们发现，在IGF-1和100 U/ml EPO联合组中，在诱导第7天经免疫细胞染色NSE阳性率明显高于同浓度单独IGF-1组和单独EPO组及对照组。结果表明，实验中我们施加胰岛素样生长因子-1与促红细胞生成素对NSCs的分化过程中存在协同作用，这种协同作用跟因子的作用浓度有关。已有研究报道，在细胞过氧化损伤之前，加入IGF-I可以阻止神经细胞的凋亡。IGF-1这种神经元保护作用是通过预先激活磷酸肌醇-3 激酶（PI3-K） 和Akt而发挥作用的［8］。同时也有报道， EPO能通过NF-KB介导的基因转录途径以及Akt的激活，从而防止N-甲基-D-天门冬氨酸（NMDA）所诱导的神经细胞凋亡［9］。以上研究报道提示IGF-1和EPO在神经系统的发育、增殖、分化中可能存在共同的信号转导途径，即PI3-K/Akt途径。综上所述， EPO和IGF-1对神经干细胞的分化存在协同作用，且两因子在信号转导途径上存在一定联系。如果能对上述机制，特别是体内信号传导途径加以研究、阐明，定将有助于最终实现神经干细胞在中枢神经系统疾病治疗中的应用。
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