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作者：李尚滨作者单位：山东大学山东省立医院美容整形烧伤科，山东 济南 250021 # h8 g: ^ n: L. H+ q/ C
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【摘要】 目的：观察月龄、来源部位对犬骨髓MSCs体外增殖能力及成软骨细胞分化能力的影响，对软骨组织工程种子细胞的选择提供参考。方法：体外分离、培养4月龄、12月龄Beagle犬髂骨和胫骨骨髓中的MSCs，向软骨细胞诱导分化。依靠形态学观察、原代集落生成率、MTT法测生长曲线等方法观察各组MSCs的增殖能力，通过GAG含量、Ⅱ型胶原免疫组化比较诱导成软骨细胞效果。结果：4月龄犬髂骨与胫骨来源MSCs体外增殖特性及诱导成软骨细胞特性比较差异无统计学意义；12月龄犬髂骨组MSCs较胫骨组原代融合时间短、集落生成率高、生长曲线左移，但成软骨细胞特性无差异。相同部位比较，4月龄来源MSCs均较12月龄表现出较高的增殖能力和成软骨细胞分化能力，差异具有统计学意义。结论：成年犬不同部位来源MSCs增殖能力不同，分化能力相同；幼龄犬MSCs增殖、分化能力均高于成年犬。 + n( }& P& `: V$ P4 f5 y
【关键词】间充质干细胞 犬 年龄 增殖 成软骨分化, Z# C; I) u& o4 F* j( W. R
AEffect of age and origin on proliferation and chondrogenic differentiation
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" y7 b; }- O% n& w' _ Gcapabilities of canine bone marrow mesenchymal stem cells in vitro
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［ABSTRACT］Objective: To explore the effect of age and origin on the proliferation and the chondrogenic differentiation capability of canine mesenchymal stem cells(MSCs) in vitro. Methods: MSCs isolated from bone marrows of the iliac bone and the shin bone in 4month and 12month canines, were cultured and induced into chondrocytes in vitro. The growth, purification, proliferation and chondrogenic differentiation abilities of MSCs in 4 groups were determined by using the clone forming rate and the MTT method. The GAG content and the positive cell rate of collagen Ⅱ were determined. Results: The proliferation and the chondrogenic differentiation abilities between MSCs isolated from iliac bones and shin bones were not statistically different in 4month canines. In the 12month canine groups, MSCs showed a shorter primary culture time and a higher cloneforming unit rate from iliac bones than from shin bones, whereas the expression of GAG and collagen Ⅱ was not positively different. Both the proliferation and the chondrogenic differentiation abilities were higher in the 4month groups than in the 12month groups. Conclusion: The proliferation ability of MSCs from both sites is different in the 12month canines, while the chondrogenic differentiation capability is not significantly different. The proliferation and the chondrogenic differentiation capabilities of the 4month canines are higher than those of the 12month canines.
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［KEY WORDS］Mesenchymal stem cells(MSCs); Canine; Age; Proliferation; Chondrogenic differentiation
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/ I3 m% E4 v* [9 l- E种子细胞是组织工程学技术三大要素之一，如何获得大量稳定分化的种子细胞是组织工程化能否成功的先决条件，也是现如今组织工程研究的难点之一。1966年Friedenstein等［1］发现骨髓基质中存在骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs），因其具有多向分化潜能而逐渐成为组织工程学的研究重点。骨髓在长骨和扁骨内的生长在不同的年龄阶段有着不同的特点，年龄与部位是否会对MSCs的体外增殖能力及诱导成软骨细胞能力产生影响？本文以Beagle犬为实验对象，进行了初步研究。9 g6 \3 ?$ p8 f* B
- V+ A0 U+ t& t* r' ?7 b$ f6 i( o9 j1材料与方法1 T. u2 f0 ]6 Z; }( @0 Z5 ~
) G1 Q3 ]5 i& }! e, c7 L1.1实验动物4月龄和12月龄雄性Beagle犬各6只，体重分别为6.5 7?kg和13.5 14?kg。每只犬均同时行髂骨及胫骨两处穿刺，依照月龄和穿刺部位不同分为4月龄髂骨组、4月龄胫骨组、12月龄髂骨组、12月龄胫骨组4组。+ z! c. ~% a0 T! ?/ @/ v: G: _
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1.2主要试剂与仪器1.073?g/ml Percoll分离液（1.131?g/ml密度原液由Pharmacia公司提供，所使用密度工作液为自行配制），LDMEM细胞培养基(Gibco，美国)，胎牛血清（四季青公司，杭州），TGFβ1、 IGFⅠ(Peprotech，美国)，兔抗人Ⅱ型胶原免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒（中杉科技公司，北京）， CO2细胞培养箱（Thermo Forma 371，美国）、IX71倒置相差显微镜(Olympus，日本)、酶联免疫检测仪(Spectra Max M2，美国)。
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1.3骨髓穿刺髂骨穿刺点选在左侧髂后上棘后下约1?cm骨质较平处；胫骨穿刺点选在左后肢胫骨平台内下方0.5 1?cm骨质较平处。麻醉、消毒后，以16号骨穿针垂直穿入皮质，有突破感时停止，抽取骨髓6?ml，空针内预留3?000?u/ml肝素钠溶液2?ml。/ {9 A. Q5 {6 p, i
% w3 w$ a5 C0 R) u% h; A1.4MSCs分离纯化与培养各组所取骨髓经无血清培养基洗涤稀释后，按1∶1体积比例缓慢加入到1.073?g/ml Percoll分离液之上，3?000?r／min离心25?min；离心后离心瓶内液体共分为4层，小心吸取第2层白色膜状层，加入适量无血清培养基洗涤2次。细胞计数板计数，以2105个/cm2密度接种于100?mm培养皿内。加入含15%胎牛血清的LDMEM培养基8?ml，置入CO2细胞培养箱内。72?h半量换液，第5?d全量换液，以后隔日换液一次。待贴壁细胞达到80% 90%融合时使用0.25%胰酶消化，按照1∶2或1∶3的比例进行传代。# e: B& S: T, R0 W' d* ?; U7 k
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1.5MSCs体外向软骨细胞诱导收集各组第3代细胞，细胞培养基内加入浓度为10?ng/ml TGFβ1、10?ng/ml IGFⅠ、37.5?μg/ml维生素C、6.25?μg/ml转铁蛋白进行诱导，未诱导组仍使用完全培养基作为对照，相同条件培养传代。
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1.6观察方法与指标6 W4 N$ R, S( z; R( X. j; \$ W
" S' y0 s) Z" k& _/ E: H' F# @7 v1.6.1细胞培养形态学观察每日相差显微镜下观察细胞形态、生长情况、原代融合时间等。
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/ n3 a- h7 c4 v1 p/ P L1.6.2MSCs集落生成率在100?mm培养皿底部预先以标记笔画出间隔为1?cm的正方形网格线。各组分离所得细胞均以2105个/cm2密度接种于培养皿内，5?d时首次全量换液，去除悬浮细胞，并在相差显微镜下计数随机抽取的5个网格内MSCs集落形成数目。规定所选集落内细胞数目在50个以上。' q) O7 _( {& B1 w" q% Y
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1.6.3MTT法测定生长曲线收集各组第2代细胞以1104个/ml接种于96孔板内，每孔200?μl，每日定时各取3孔，以MTT比色法测定各孔490?nm波长下的光吸收度（OD值），取平均值。连续测定10?d，绘制细胞生长曲线。
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/ P9 I7 J2 i" r* a+ d' Y" z( m+ n7 A1.6.4培养液糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）含量检测分别取各组诱导MSCs第14天培养液100?μl，加到含1.5?ml新鲜配制阿尔新兰溶液的试管内，酶联免疫检测仪490?nm下进行比色，测其光吸收度值。以硫酸软骨素制作标准对照曲线，计算出培养液内GAG含量。同法测定平行培养未诱导MSCs培养液GAG含量，得出两者差值。/ u1 ^6 R2 K0 s) K! W% Y
: f- g# E+ r) |) m* {1.6.5细胞爬片Ⅱ型胶原免疫组化染色取各组诱导第14天MSCs，作细胞单层爬片。以兔抗人Ⅱ型胶原抗体作一抗，SP法进行免疫组化染色，DAB显色后进行观察；随机抽取细胞爬片中5个高倍视野,计算阳性细胞数占总细胞数的百分比，得出免疫染色阳性细胞的百分比［2］，进行比较。
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1.7统计方法所有结果均使用均数加减标准差! C. b7 b- p5 y! l6 I: @; Z/ q
2 M, ^# S/ C7 t 2结果
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$ `' k8 r+ e/ M* V5 y2.1细胞形态学观察倒置相差显微镜下观察原代细胞24?h开始逐渐有细胞贴壁，72?h时贴壁细胞明显增多，细胞变大，呈梭形，单个分散存在（图1）。5?d左右贴壁细胞呈小集落聚集生长，细胞增粗变长，有突起伸出，细胞逐渐呈多边形（图2）。7?d左右见细胞放射状、漩涡状生长，集落扩大，相邻集落互相融合（图3）。各组中，4月龄髂骨及胫骨来源细胞生长速度较快，集落融合时间早，约9 10?d原代铺展面积即可达到80%左右；而12月龄来源细胞贴壁较慢，集落较小且分散，原代融合时间较晚，其中髂骨来源细胞约需10 12?d方可达到80%左右铺展面积，而胫骨来源细胞在第12?d左右时仅能达到60%左右铺展面积。
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2.2集落生成率比较各组MSCs集落生成率见表1。分别进行t检验，4月龄两部位来源MSCs集落生成率之间差异无统计学意义（t=0.65，P=0.53＞0.05）；12月龄髂骨来源MSCs集落生成率较胫骨来源组高，差异有统计学意义（t=5.97，P=0.00＜0.05）。相同部位不同年龄组别之间比较，4月龄来源组别集落生成率均较12月龄组别高，差异具有显著统计学意义（P均小于0.01）。表1不同部位胫骨平台; F1 R7 [# [4 D$ g! j7 h: ?
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2.3生长曲线各组第2代MSCs生长曲线见图4。各组MSCs生长曲线均呈“S”形，在对数生长期之前有一段明显较为平缓的生长潜伏期。4月龄两组MSCs潜伏期约为2?d，3?d左右生长速度突然加快，持续到6 7?d达到高峰，然后进入平台期，速度减慢； 12月龄MSCs潜伏期约为3 4?d，细胞才能进入对数生长期，在第9?d左右达到高峰，以后进入平台期。
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5 f" ?7 X' ~* |/ _2.4细胞培养液糖胺聚糖含量检测各组细胞培养液GAG含量见表2。各组诱导细胞培养液GAG含量均较未诱导含量升高，其差值采用t检验比较得出：4月龄髂骨组与胫骨组之间（t=0.83, P=0.43＞0.05），12月龄髂骨组与胫骨组之间（t=1.06, P=0.31＞0.05）差异均无统计学意义；4月龄髂骨组GAG含量差值较12月龄髂骨组高（t=3.87,P=0.003＜0.05），4月龄胫骨组GAG含量差值较12月龄胫骨组高（t=4.37,P=0.001＜0.05），差异均有统计学意义。' z C( r/ x' d# G' N; u
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2.5细胞爬片Ⅱ型胶原免疫组化染色各组MSCs诱导14?d后均可见Ⅱ型胶原阳性细胞出现，阳性位置位于胞浆内，呈棕黄色至棕褐色，在胞核周围更加明显（图5）。各组Ⅱ型胶原阳性细胞率见表3。4月龄不同部位之间（t=0.34,P=0.74＞0.05），12月龄不同部位之间（t=1.52,P=0.16＞0.05）比较差异均无统计学意义；髂骨来源组4月龄较12月龄阳性细胞率高（t=2.99,P=0.02＜0.05），胫骨来源4月龄阳性细胞率同样高于12月龄组（t=5.13,P=0.00＜0.05），差异均有统计学意义。表2各组诱导与未诱导细胞培养液GAG含量（4月龄髂后上棘4月龄胫骨平台12月龄髂后上棘12月龄胫骨平台未诱导组GAG含量 表3各组诱导14?d MSCsⅡ型胶原免疫组化阳性细胞率; c( ^- @8 K) t1 X6 l, G
( Q2 g) Y0 ?0 _: w/ o3讨论
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自体MSCs因其低免疫原性、无限扩增性及多向分化潜能而逐渐成为软骨组织工程理想的种子细胞［3］。由于MSCs在骨髓中含量只有1/106 1/105［4］，其成功分离培养并能短时间经扩增达到组织工程种子细胞的数量要求（107）［5］成为进一步研究的关键。有研究表明，MSCs增殖能力和成骨细胞分化能力随年龄增长明显下降［6］，但年龄对成软骨细胞分化能力的影响尚未有报道。此外，骨髓在扁骨和四肢长骨骨髓腔内生长在不同年龄时期有不同的特点［7］。 Lee HS等［8］曾研究表明在成人股骨骨髓中含有未分化的MSCs，可成功向软骨及成骨细胞诱导。但目前国内外尚未见对不同位置来源的MSCs增殖能力和软骨细胞分化能力差异的研究。此问题的研究，有助于为软骨组织工程提供增殖能力和分化能力较为理想的MSCs。
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( y# Z1 l* W0 W$ Y# W$ J2 N本实验结果初步显示：随着年龄的增长，MSCs增殖能力和成软骨细胞分化能力下降。就相同年龄不同位置来源MSCs而言，4月龄来源髂骨组与胫骨组MSCs均表现出较强的增殖能力和分化能力，说明在低龄动物骨髓来源位置对MSCs体外增殖能力和分化能力无明显影响。12月龄髂骨来源MSCs集落生成率高，原代铺展面积大，生长速度较快，但GAG和Ⅱ型胶原阳性细胞率的比较两组之间未见显著差别，表明虽然胫骨来源MSCs扩增能力下降，但体外诱导成软骨细胞分化能力与髂骨来源细胞并无显著下降。, G4 o- p9 e/ a. J* C
& R0 y( E6 g2 M3 h5 D, U9 v8 d随着年龄增长，骨髓中骨髓基质细胞分泌的体液因子发生改变，导致造血诱导微环境变化，骨髓造血功能降低，逐渐向黄骨髓转化，这种改变在股骨、胫骨等四肢长骨中最先发生和最为明显。这可能是年龄和位置因素引起MSCs增殖能力和分化能力下降的具体表现。本实验结果中，成年组胫骨来源MSCs体外诱导成软骨细胞能力下降不如增殖能力明显，可能是受到体外细胞因子TGF、IGF等较强的促增殖和促软骨细胞基质分泌的影响。这同时也从另一方面证明了MSCs的增殖能力和成软骨细胞分化能力与来源骨髓微环境体液因子变化密切相关。这种影响具体的发生机制还有待于进一步研究。
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