|
 
- 积分
- 631
- 威望
- 631
- 包包
- 1519
|
【材料及准备】
1 a! Z* t8 x# S; ~1.一般的盖玻片，或专用爬片；
! P1 g- C% m6 u2.根据需要剪裁成合适的大小，以备置于6孔板、12孔板或24孔板；
6 P+ H1 J( X$ C7 H3.将剪裁好的爬片，置于浓硫酸中浸泡并过夜，第二天先用自来水冲洗20遍，再置于无水酒清中浸泡6小时，再用三蒸水冲洗3遍，放在饭盒或者玻璃培养皿中烘干后进行高压消毒。
5 |0 K1 v: ]1 f4.高压后取出放入烤箱中烤干，备用。烤干后可放入超净台中。3 v# A; j/ T. b* y7 [4 f- ~2 W
5.关于多聚赖氨酸，很多人都将玻片用此处理，以使细胞与玻片结合更牢。
/ h* x, V) V( B6.常用的固定液; A7 s/ S0 r7 a& [ ]
6.1丙酮 可用于一般的免疫组化染色。
& Q( s2 a* A5 X" N7 q- q& y" e将纯的丙酮预先放入冰箱-20℃后便为冷丙酮（放心，丙酮在此温度不会为固体的）细胞爬片取出后，PBS洗2遍，便可加入冷丙酮于-20℃（丙酮有很强的挥发性，注意将含有丙酮和爬片的器皿盖严，防止其挥发）固定10分钟。取出后，室温吹干，然后放入-20℃保存。+ i6 d, |. h7 T2 _+ G, c) B1 I, E
) [$ L' W; L! G4 \3 T$ N- ?: o. u
6.2 多聚甲醛(常用4%)：可用于免疫电镜；也可用于免疫荧光以及TUNEL染色。
" d3 o/ G1 a- A. ]主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗原，例如各类淋巴细胸分化决定簇(CD)、主要组织相容性抗原等, ^. l- [& n/ Z2 W# Q& p( h; z1 y4 b
室温固定15分钟后，将表面液体吹干，入-20℃保存
, Q/ E+ B9 Z2 y) N! |( a9 b# C5 \, F6 z8 z. U6 U$ V/ i
6.3 95％乙醇，可用于免疫组化。& Z2 t5 Y; U/ ?( [ R: G3 G
优点：穿透性强、抗原性保存较好。- o0 W! g/ _- A
缺点：但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差，使蛋白变性的作用轻，固定后可再溶解；染色过程中，温育时间长，抗原可流失而减弱反应强度
, z# d% i( J& X: q& D4 z& O5 J室温固定15分钟后，将表面液体吹干，入-20℃保存
. N" P' U; @7 {* |& X6 p7 R g# T' V+ q- [* h5 v2 w- O
6.4 甲醛(福尔马林)应用最广 3 q/ e4 f7 B2 I
优点：形态结构保存好，且穿透性强，
% j+ {% ~ r0 D- B7 @- q, @缺点： 甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液pH降低，影响染色； 分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露。可造成假阴性的染色结果。) } M4 i5 R' Z: d% n
) D1 |* ] v y7 L6 G
【细胞爬片步骤】/ l+ d% F8 j- d5 S+ f/ `
1.胰酶消化细胞后计数重悬细胞于完全培养基中。; _# _3 Z* U9 u! K, _( l
2.加细胞时，根据玻片的大小，先在每个孔里准备放爬片的位置滴少量培养基，目的是使玻片与培养皿靠培养基的张力粘合到一起，然后放玻片，防止加细胞悬液时玻片漂起，造成双层细胞贴片。整个过程注意无菌操作。" w9 O1 @; B' K* K* w
3.根据自己的需要选择合适的细胞密度种入培养板内即可
* E5 G! k3 W! L3 |7 H4.待细胞贴壁后，可去上清加含药培养基。, a; U |% J K# H0 R# l
5.按照实验设计，作用一定时间后取玻片。取玻片时由于玻片与培养皿底结合较紧，张力较大，一般将注射器针头针尖向背面弄个小钩，这样将爬片轻轻勾起，用小镊子取出就可以了。如果要做诸如24h，48h，72h等这样时间点的实验的话，将所需数量的爬片取出时应用酒精灯火焰烧一下针头和镊子。末取出的可接着继续培养。
: k/ ^! ^: j4 S% l8 K
! W2 K+ ]( Z h( ^- N4 @/ J, |' ?【细胞爬片的固定】# a Y% h7 A2 }4 h8 [% i. I
细胞爬片取出后，一般用PBS洗2遍，然后再做固定。当然，根据研究目的，PBS洗也不是一定要做的，比如做凋亡的TUNEL染色时就避免洗，因为凋亡的细胞在洗的过程中有可能会脱落。/ g2 \( {. y2 v
另外在保存细胞爬片的时候，一般用培养皿或板，先在皿底放一层面巾纸，然后再放爬片，这样方便做实验时取片。然后盖上盖子，并在盖子上做标记，为避免混淆，可用透明胶带将盖子和皿连在一起。一般-20℃保存2-3个月的片子做免疫组化是没有问题的。; ^, N C+ r- r+ p. i
( {7 [7 ~1 \) ~; P' m& M
# c3 I6 H0 e) R( t$ R; }+ |7 g( B |
-
总评分: 威望 + 10
包包 + 20
查看全部评分
|
发表于 2011-6-23 22:26
