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【材料及准备】* w' m3 S) }3 Z+ u1 }; V Q& o
1.一般的盖玻片,或专用爬片;
& H: y! d4 m7 x7 w( e1 O* z2.根据需要剪裁成合适的大小,以备置于6孔板、12孔板或24孔板;
4 ` c# O q% x- W4 ]$ x3.将剪裁好的爬片,置于浓硫酸中浸泡并过夜,第二天先用自来水冲洗20遍,再置于无水酒清中浸泡6小时,再用三蒸水冲洗3遍,放在饭盒或者玻璃培养皿中烘干后进行高压消毒。/ j# C$ D* _3 ~5 a3 e
4.高压后取出放入烤箱中烤干,备用。烤干后可放入超净台中。6 f9 B, @& O- t% E. [2 [& d& W
5.关于多聚赖氨酸,很多人都将玻片用此处理,以使细胞与玻片结合更牢。
& f: n: Y7 |: @7 |$ M6.常用的固定液1 ?: f" s+ w; H3 `: x
6.1丙酮 可用于一般的免疫组化染色。
1 M' w% a# X) o& z( ]$ M6 w1 i1 E将纯的丙酮预先放入冰箱-20℃后便为冷丙酮(放心,丙酮在此温度不会为固体的)细胞爬片取出后,PBS洗2遍,便可加入冷丙酮于-20℃(丙酮有很强的挥发性,注意将含有丙酮和爬片的器皿盖严,防止其挥发)固定10分钟。取出后,室温吹干,然后放入-20℃保存。
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- A6 z1 j6 L* o$ y6.2 多聚甲醛(常用4%):可用于免疫电镜;也可用于免疫荧光以及TUNEL染色。 ) S4 u. K' o) m$ o2 i
主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗原,例如各类淋巴细胸分化决定簇(CD)、主要组织相容性抗原等; o4 `4 d7 S- A6 a
室温固定15分钟后,将表面液体吹干,入-20℃保存2 M- T* ~% p' u6 U
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6.3 95%乙醇,可用于免疫组化。- p: U: F0 @9 a+ R
优点:穿透性强、抗原性保存较好。
% u5 b0 S7 u' _5 z6 J缺点:但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差,使蛋白变性的作用轻,固定后可再溶解;染色过程中,温育时间长,抗原可流失而减弱反应强度* |1 v3 f' i* D+ _+ A' T; U) Y
室温固定15分钟后,将表面液体吹干,入-20℃保存
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2 ]3 p" x& p Y6.4 甲醛(福尔马林)应用最广 5 p2 q, }8 X+ E% x8 N5 m4 s+ p
优点:形态结构保存好,且穿透性强,. Q+ g. \1 r+ S3 @
缺点: 甲醛放置过久可氧化为甲酸,使溶液pH降低,影响染色; 分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇,使之不能充分暴露。可造成假阴性的染色结果。7 v. h: ]# \6 X- |5 C. x+ }' N# V
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【细胞爬片步骤】
6 k8 w: m6 L, e6 m1.胰酶消化细胞后计数重悬细胞于完全培养基中。 q; K D3 p- T% W# g! U
2.加细胞时,根据玻片的大小,先在每个孔里准备放爬片的位置滴少量培养基,目的是使玻片与培养皿靠培养基的张力粘合到一起,然后放玻片,防止加细胞悬液时玻片漂起,造成双层细胞贴片。整个过程注意无菌操作。
; X9 s8 R2 x/ ^& J1 x! Q3.根据自己的需要选择合适的细胞密度种入培养板内即可
- z+ c! o0 r. H0 i* k1 Y+ u, _4.待细胞贴壁后,可去上清加含药培养基。
9 x6 [7 J X+ j/ p6 k4 Q0 _- ^5.按照实验设计,作用一定时间后取玻片。取玻片时由于玻片与培养皿底结合较紧,张力较大,一般将注射器针头针尖向背面弄个小钩,这样将爬片轻轻勾起,用小镊子取出就可以了。如果要做诸如24h,48h,72h等这样时间点的实验的话,将所需数量的爬片取出时应用酒精灯火焰烧一下针头和镊子。末取出的可接着继续培养。
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【细胞爬片的固定】
$ m0 s* R' B( d" G, C细胞爬片取出后,一般用PBS洗2遍,然后再做固定。当然,根据研究目的,PBS洗也不是一定要做的,比如做凋亡的TUNEL染色时就避免洗,因为凋亡的细胞在洗的过程中有可能会脱落。
3 m+ g9 t. ~ r( U9 t+ ^0 q另外在保存细胞爬片的时候,一般用培养皿或板,先在皿底放一层面巾纸,然后再放爬片,这样方便做实验时取片。然后盖上盖子,并在盖子上做标记,为避免混淆,可用透明胶带将盖子和皿连在一起。一般-20℃保存2-3个月的片子做免疫组化是没有问题的。
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