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【材料及准备】1 _. Z' m" _! c: h& v+ ]; I
1.一般的盖玻片，或专用爬片；: A# `: |* I- o
2.根据需要剪裁成合适的大小，以备置于6孔板、12孔板或24孔板；( U6 r k9 y( R/ c
3.将剪裁好的爬片，置于浓硫酸中浸泡并过夜，第二天先用自来水冲洗20遍，再置于无水酒清中浸泡6小时，再用三蒸水冲洗3遍，放在饭盒或者玻璃培养皿中烘干后进行高压消毒。
4 {5 g0 u: x2 z$ u# s m. w4.高压后取出放入烤箱中烤干，备用。烤干后可放入超净台中。2 T+ @; e0 {! T7 \& Q/ x
5.关于多聚赖氨酸，很多人都将玻片用此处理，以使细胞与玻片结合更牢。
3 s0 D Z* ~! C6.常用的固定液2 [5 r% @' F8 M1 m
6.1丙酮 可用于一般的免疫组化染色。
! D4 _* E! G# C" x; U将纯的丙酮预先放入冰箱-20℃后便为冷丙酮（放心，丙酮在此温度不会为固体的）细胞爬片取出后，PBS洗2遍，便可加入冷丙酮于-20℃（丙酮有很强的挥发性，注意将含有丙酮和爬片的器皿盖严，防止其挥发）固定10分钟。取出后，室温吹干，然后放入-20℃保存。
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- Q) B9 n. P% P+ D$ U5 T6.2 多聚甲醛(常用4%)：可用于免疫电镜；也可用于免疫荧光以及TUNEL染色。 . ]1 ], \+ I5 j" |$ q
主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗原，例如各类淋巴细胸分化决定簇(CD)、主要组织相容性抗原等% i, R) Q( i9 d. _9 B& h( ~
室温固定15分钟后，将表面液体吹干，入-20℃保存
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4 g/ L# u$ t; W/ R0 S/ p6.3 95％乙醇，可用于免疫组化。+ n3 P5 l: h3 W0 ?7 N9 P8 i
优点：穿透性强、抗原性保存较好。& s$ D$ _ j! E; V# m
缺点：但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差，使蛋白变性的作用轻，固定后可再溶解；染色过程中，温育时间长，抗原可流失而减弱反应强度0 ~3 |4 _1 j5 j7 I* z
室温固定15分钟后，将表面液体吹干，入-20℃保存
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4 X" t5 m4 a% m( ~( G# {6.4 甲醛(福尔马林)应用最广
+ L% `1 ~( v, Q2 X4 m, p- O# D, F优点：形态结构保存好，且穿透性强，
z. o$ s+ n$ M- G7 X( x缺点： 甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液pH降低，影响染色； 分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露。可造成假阴性的染色结果。5 t: M( ]& g( K- L
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【细胞爬片步骤】
1 M3 O5 c4 f! |+ K1 ]# G1.胰酶消化细胞后计数重悬细胞于完全培养基中。3 O# g: z8 Z" [, J
2.加细胞时，根据玻片的大小，先在每个孔里准备放爬片的位置滴少量培养基，目的是使玻片与培养皿靠培养基的张力粘合到一起，然后放玻片，防止加细胞悬液时玻片漂起，造成双层细胞贴片。整个过程注意无菌操作。
3 v& w( O5 @, K I9 D& l3.根据自己的需要选择合适的细胞密度种入培养板内即可
0 A8 g8 P. A8 w* g4.待细胞贴壁后，可去上清加含药培养基。+ h, w) j' o& d) \8 J' |
5.按照实验设计，作用一定时间后取玻片。取玻片时由于玻片与培养皿底结合较紧，张力较大，一般将注射器针头针尖向背面弄个小钩，这样将爬片轻轻勾起，用小镊子取出就可以了。如果要做诸如24h，48h，72h等这样时间点的实验的话，将所需数量的爬片取出时应用酒精灯火焰烧一下针头和镊子。末取出的可接着继续培养。
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$ _/ Y4 p* [0 W+ R M- w8 l【细胞爬片的固定】* s J3 a4 Z$ W; z1 i w* ]7 Q
细胞爬片取出后，一般用PBS洗2遍，然后再做固定。当然，根据研究目的，PBS洗也不是一定要做的，比如做凋亡的TUNEL染色时就避免洗，因为凋亡的细胞在洗的过程中有可能会脱落。+ ?5 q# w l! u5 V* k$ A* ?
另外在保存细胞爬片的时候，一般用培养皿或板，先在皿底放一层面巾纸，然后再放爬片，这样方便做实验时取片。然后盖上盖子，并在盖子上做标记，为避免混淆，可用透明胶带将盖子和皿连在一起。一般-20℃保存2-3个月的片子做免疫组化是没有问题的。5 I+ {; N b' z j/ e: d0 [, q+ i
* }, b b' x+ B6 g& S1 B/ q# k& L8 V/ H6 k9 J
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发表于 2011-6-23 22:26
