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可参考BIOG实验步骤& v5 I0 ?( [3 _
(请自备50mL离心管、20mL离心管、异丙醇、70%乙醇): P" A" y {) S/ j9 k
取50mL菌液,置于50mL离心管中,4000rpm 4℃离心5 min,彻底弃除上清。
7 T5 c. j3 K0 [! w加入3mL溶液A,充分振荡2min,使菌体充分悬浮,确保无絮块存在。4000rpm 4℃离心5min,彻底弃除上清。
; V9 q. z6 f, F9 r, Y3 z加入2mL溶液I和40uL溶液B,充分振荡2min,使菌体充分悬浮,确保无絮块存在。" F; [' A7 \8 r" I
加入4mL溶液II,盖紧管盖,轻轻颠倒混匀6次,注意整个管子的内表面均需与溶液II接触,室温放置至溶液清亮。(一般为4-5min,如5min后溶液未变清亮,说明细菌过多,应考虑减少菌液量。注意混匀手法要温和,不要剧烈混合)
2 C" _0 c1 u% D9 E加入3mL溶液III,盖紧管盖,立即轻轻颠倒混匀8次,4℃放置5min。(此步注意要尽快混匀,但手法要温和)
* p0 H0 ~7 J) i$ q1 p$ Y2 y" N10000rpm 4℃离心15min,小心吸出上清,轻移至新的20mL离心管。(应在离心机自动停转后取出离心管,以免沉淀悬浮)( I/ R& P3 P+ r* b3 U# Y& j$ _
加入6mL异丙醇,充分混匀,室温放置10分钟。10000rpm室温离心15min,小心吸弃上清,用吸水纸尽量吸去残余的液体。
% Q* s7 o* x$ Q# Z, N5 l(应在离心机自动停转后取出离心管,以免沉淀悬浮)7 @$ d6 d1 \5 V* l7 G5 {
加入3mL 70%乙醇,温和震荡30Sec,10000rpm离心10min,轻轻弃去上清,用吸水纸尽量吸去残余的液体,室温晾干沉淀。+ R6 o" o2 V. w0 M# [
加入0.3mL溶液IV,温和震荡2min,使沉淀完全溶解并转移至新的1.5mL离心管中。
7 }. s" R! W1 C" n A$ {加入10%体积溶液V,充分混匀,冰浴5min。
8 W5 [/ k1 |- A2 v) D/ P加入3%体积溶液VI,反复吹打混匀,旋涡震荡15min。# e0 B& G4 ]! h* v
50℃水浴5min,室温12000rpm离心3min,溶液分相后,吸取上层水相至新的离心管中。
( V% V0 O% _1 T3 Y! @重复步骤10~12两次。
9 ^) Q$ H& Z9 K加入700uL无水乙醇,充分混匀,室温放置5分钟。12000rpm离心10min,小心吸弃上清,用吸水纸尽量吸去残余的液体。* y1 l, U. U. S! L3 K3 Y
加入700uL70%乙醇,温和震荡30Sec,12000rpm离心5min,轻轻弃去上清,将离心管倒置于吸水纸上,吸去残余液体,室温晾干沉淀。
' A; F$ M/ n! v加入50μL溶液IV,温和震荡2分钟,使沉淀完全溶解。 |
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