人ES细胞用悬滴法形成EB，形成的EB状态老是不好~~~

ielisa

培养的人ES细胞，传代时收集细胞，做成悬滴，30微升每滴，在培养皿盖内表面悬滴培养两天后再悬浮培养，已经做过两次了，可是形成的EB状态一直都不好~~就可以说完全没有形成EB，克隆松散，形状不规则，并且颜色也是灰色那种，根本不是亮黑色~这是怎么回事啊？我做的悬滴太小？悬滴的48小时内部营养已经消耗殆尽了？还是我做悬滴时把细胞打的太散了？抑或是细胞状态本身的问题？求各位大侠给指点迷津一下啊！！！！实在是很着急啊！！！哪位大侠有ES形成EB比较好的protocol能否共享下啊？实在是非常感谢了！

小禾禾

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' c9 {) x, J* x& Z0 y* F0 r2 X8 r
# _* Y0 K% o% x- E; z你使用什么酶消化的？消化时间是多少？做人ES的EB，一般不用悬滴法，常采用低吸附的培养皿悬浮培养即可。

细胞-77

有图吗？能否上传几张图来看看，图才能够直观的反应你的问题。可能是你的操作中的细节没有注意好吧。  L: w) y, w2 N8 ?! p

sunny1987324

我也遇到相同的问题，只不过我培养的是小鼠的ES.希望高人指点。

ielisa

回复 小禾禾 的帖子( Z8 N/ h0 x. ^# V. V- I

! P, Q4 z  {9 {& K; U# X8 m8 |+ p胶原酶消化大概45min，我们实验室倒是有那种培养皿，我是看文献说悬滴法形成EB质量好，效率高才用悬滴法的，下次我试试不用悬滴法吧

ielisa

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. G+ K. i8 a9 }; P" m. `3 D* m7 V$ ]+ f5 d
这次的没拍照，形成的EB要么就是很小很散，要么就是完全散掉了，没有成行，请问你有好的protocol没有？或者操作过程应该注意哪些细节呢？

小禾禾

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$ b& V, T- A* r" ?
; \; u" P5 {- ~: ?) _- [胶原酶几？然后消化时间太长了。。几分钟就可以了。一般小鼠ES采用悬滴，而人的不是

ielisa

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2 j: u7 |( `! @" I" B3 V% p0 ?3 {9 p) g4 _- W
IV，恩，好，我下次试验一定注意下

BDFCM

回复 ielisa 的帖子' y0 S- w. r2 e8 N) d

0 ^0 p" `7 h+ g$ x% y' w. |: H人胚胎干细胞单细胞悬滴法是不可行的，小鼠的ES用悬滴法是比较合适的。1 M% |% y+ T& v8 y0 Z$ m) {& {
人的ES通常是类似传代的消化，只是划线之后，把clusters转到低贴附的培养板里，悬浮培养形成EB。% j3 n' ~$ k, I$ o
你可以试试

sdjnkx

胶原酶的浓度，或者消化时间