急求:关于流式细胞仪对细胞表面抗原鉴定的问题

李兰兰

请教大家一下，我的染色步奏有没有问题？' l$ J( U& A( r3 B
1、第一代大鼠骨髓间充质干细胞80%融合时，胰酶消化，含10%血清培养液进行终止，1000转，6min离心一次，然后加入ph7.4的PBS洗涤一次，加入0.5ml的PBS重悬细胞。! ]2 f. M8 n$ h: B
2、加1微升的一抗CD34、CD45、CD90、CD105，冰上放置30min。
% {0 D) V& x2 K; S6 P3、加PBS洗涤2次，以0.5mlPBS重悬细胞，加入相应二抗1微升，湿冰避光放置30min。- E3 @8 b: _. @. x4 C8 S! B
4、加PBS洗涤3次，以0.5mlPBS重悬细胞，上机。( Y: Q) d/ e9 n4 Q' o8 R, f
  @4 n  W0 L: s; u4 ~( t( W/ _0 L$ w
结果四种抗体及阴性对照的图基本上一样，结合率非常低，0.7%左右。/ e# H7 F& E3 v4 v3 @
请问各位应该是什么步奏有问题，应怎样改进。急求各位指点

李兰兰

一抗CD45、CD90是abcam公司的，CD34是santa cruz 公司，CD105是millipore公司的，二抗是FITC及PE标记的，是北京奥博森生物技术有限公司的
; ^. r6 s% v' `  T) T

xiaoyurly

不知道抗体的特异性怎么样，是专门抗大鼠的吗？流式抗体一般要求比较专一5 T9 p9 _" a; @& a, c, |) |
最好分开染，染色时细胞计个数，一般抗体1ul大概能染10^6左右，流式检测有2-5×10^5就挺多了，另染色时控制体积在50ul左右，别太大，孵育过程中隔段时间轻弹管壁混一下

湖南干细胞

回复 李兰兰 的帖子1 j8 |) i$ U& l# q4 c$ ]6 b

. ~0 r1 a" o4 D" y7 @/ J我的细胞养了几代了都没有做鉴定，怕细胞不纯，做出的结果不好。你的第几代？( w( _% Q0 e/ I+ d; E3 \! K0 s

飞翔的十字架

abcom的抗体应该没有问题，santa的看运气，加抗体后孵育最好放摇床上，有利于抗体结合  P* u- o9 C$ {3 W* A3 F
9 k% y: t- \$ [# p
还有，第一代不需要做鉴定，一般不会拿P1做实验的，我P2，P3都很纯，没区别

叮铃叮铃

学习

李兰兰

回复 飞翔的十字架 的帖子
6 m$ M4 u& p0 w# m' ?* Y2 ]$ {5 {' m+ X
你们孵育是室温么？  一抗i和二抗一般加多少量

飞翔的十字架

回复 李兰兰 的帖子% E& _3 e' m1 j- \: R

, U7 |; O% {4 v7 u4 i) D4度孵育，二抗一般一微升足够，一抗看说明书

sjlzw

第一代不纯，一般选3-5代吧

以诚相待

你是四个一起标记的吗？抗体浓度？多标的时候浓度应该比单标高点，再有你可以单标试试怎么样？细胞得代数最好在3-5代 希望实验顺利