WB目的条带没出来

Rainbow1989

有没有哪位兄弟师妹做个collgen2和aggrecan的WB啊，actin出来了，但目的条带没出来。两个蛋白都是人髓核细胞来源的，分子量分别是142和75，一抗浓度都是1：100，能帮忙分析下原因吗

Tivah

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- n  V, [( N! \回复 Rainbow1989 的帖子
1 x* p0 j; Q# z/ w! v& ~  o8 p6 K
! h2 K5 _8 Q& X( V$ ]' v+ v没做过这两个分子的。不过如果问题可能出在抗体上的话，你确定是1:100不是1:1000？这个浓度是说明书上的还是你实验室的经验用量？2 E3 m1 v2 b# @- M! B
如果比例真是1:100，那你买的应该是国产抗体吧？你可以把公司和货号都写上来，看有没有人用过一样的。

xiaomao_zhoubo

转膜后用丽春红染色，看看你的目的蛋白的位置有没有条带；

ccwei0615

Yet, if you were using antibodies in 1:100. I guess these antibodies are from domestic supplier. You better to check the quality by positive control first.

aiver2001

我做过collgen2，组织用的肝脏，抗体用的sigma的大鼠抗体，但是浓度在1：1000就跑的很清晰了啊。如果楼主不清楚我可以发一张我跑的条带给你看下。

Andyhigh

Rainbow1989 发表于 2014-4-30 22:52
6 |6 G! O0 Y) ]7 f1 T" X有没有哪位兄弟师妹做个collgen2和aggrecan的WB啊，actin出来了，但目的条带没出来。两个蛋白都是人髓核细胞 ...

' X2 y) S, d7 l3 J
内参出来了，基本能证明你实验操作没有问题，并且细胞裂解和蛋白的释放没有问题；你需要考虑的问题是：1 _1 B% F# \5 b8 l  ^2 y' ~
1. 一抗二抗的种属问题，这个别弄错了；9 ]6 g1 r" c  X+ [7 q; B
2. 你的目的蛋白可能不如ACTIN 稳定，有可能降解，是细胞裂解后马上做的WB嘛，其次也要考虑跑胶 和 转膜的条件是否温和，防止蛋白降解。此外，你的目的蛋白比较大，转膜时间是否足够，如实在找不出原因，可以参考楼上的意见，转膜后做个立春红染色验证下。4 c' X! B0 ?3 R; l% F/ a4 j, R
3. 第三个蛋白的量是否足够，可能你的核细胞该蛋白表达很少！
0 q5 l" O# r9 u% H/ t4. 条件允许做个阳性对照，验证抗体是否有问题

Rainbow1989

放了个假，刚回来，谢谢各位兄台拔刀相助。确实觉得一抗的浓度有点大了，不过买来的抗体附带的说明书是这样要求的，下次1:1000试试看；另外蛋白浓度是6、7mg/ml,而且实验组包括阴性空白组(HADMSC)和诱导组（HADMSC-NPC），目的蛋白浓度肯定是会低些的，不知道这是不是也有很大原因。

Rainbow1989

发错了，蛋白浓度是0.6、0.7mg/ml

Rainbow1989

回复 aiver2001 的帖子! S+ k: X9 x4 P! w
( z/ i& F) r  O8 X, F  }0 ~
我们用的是abcam的抗体，抗体质量不会有问题吧，不过确实觉得一抗的浓度有点大了，但是买来的抗体附带的说明书是这样要求的，下次1:1000试试看，楼主能发条带来看看吗？谢谢

Rainbow1989

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, E3 i( c  t0 C% r. i4 ]确实需要阳性对照，还有蛋白量的问题下次也要注意的，谢谢兄台