小鼠骨髓密度梯度离心 FCM结果

dyg108

为得到小鼠骨髓单个核细胞，选用ficoll 1.077密度梯度离心。小鼠骨髓细胞以PBS（4 ml）悬浮，ficoll 4 ml，400 g，20 min离心。结束后白膜层明显，PBS悬浮细胞4 ℃过夜后染DAPI，FCM分析，结果如图：( i0 |2 G& T& s  R2 M& ]- X

2013-5-9 13:10 上传

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8 H' c4 J6 ~9 F. U
请教，第一张图红色部分是什么细胞？为什么没染上色？
. ~1 h0 T. s2 t  u6 \8 A3 {% t又取来ficoll底部的细胞，DAPI染色，FCM结果如图5 s9 @9 G2 O0 ^" u! e$ K' K

2013-5-9 13:14 上传

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  m- A6 C  t3 s
这个更是困惑了，请教大虾们

katysong

1. 其实DAPI不是一种严格的区分活死细胞的染料，如果DAPI足量的话，活细胞核也会着色，表现为弱阳性；若是要区分活死细胞，建议可以试一下7-AAD。
! e5 V  w% B  |8 G, G6 ~3 k2. 这次实验DAPI的电压是怎么调整的，怎样确定的阳性和阴性，有没有绝对阴性？
) |# W% e+ W" ~- R( _  p7 z& J3. 002中第一张图，红色部分细胞那么大应该是单核吧，是属于DAPI弱阳性还是DAPI拒染还真说不清楚；- Z! o- j; F, U5 m& U
4. ficoll底部应该大部分是红细胞，还有部分粒细胞，红细胞没有核不会被染上，但那部分绿色的确实很奇怪，绝大部分又不是粒细胞，看还有没有哪位高手可以指点一下。
& H. m9 j9 h  V' d* k

dyg108

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. u: x( J- N8 d
* _( [: R8 o* _6 S, {& [非常感谢，DAPI电压是以没有DAPI染色的细胞调的。! V$ h  Z5 t6 \5 u

lyj-0017

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; |: F0 }( X9 K4 L! |% J) f
3 P% z2 W1 x  a; C" G# r: h4 q2 }, G( F      小鼠单个核细胞的分离常用密度为1.092的小鼠淋巴细胞分离液进行分离，而分离人单个核细胞常用密度为1.077的人淋巴细胞分离液。我认为是你用的淋巴细胞分离液的问题，分离液密度不适应，所以分离出的细胞分层也不同。
& l) n; n8 N3 Q( s    另外，你小鼠骨髓细胞悬液与ficoll的体积比是1:1，而常用的外周血或者骨髓细胞悬液与ficoll的比例是2:1，也许这也是一个导致细胞分层不正确的一个因素。