急求:关于流式细胞仪对细胞表面抗原鉴定的问题

李兰兰

请教大家一下，我的染色步奏有没有问题？3 f1 g' E0 O& {- p& ~2 g
1、第一代大鼠骨髓间充质干细胞80%融合时，胰酶消化，含10%血清培养液进行终止，1000转，6min离心一次，然后加入ph7.4的PBS洗涤一次，加入0.5ml的PBS重悬细胞。
! w0 ]- j" n$ [  w9 G2、加1微升的一抗CD34、CD45、CD90、CD105，冰上放置30min。1 [) T4 O+ z# X; ?
3、加PBS洗涤2次，以0.5mlPBS重悬细胞，加入相应二抗1微升，湿冰避光放置30min。5 Z! s! N  G6 V6 h% M
4、加PBS洗涤3次，以0.5mlPBS重悬细胞，上机。* d; f  y0 N6 M: \2 m
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结果四种抗体及阴性对照的图基本上一样，结合率非常低，0.7%左右。4 q" P& o% k& {, k( k0 x
请问各位应该是什么步奏有问题，应怎样改进。急求各位指点

李兰兰

一抗CD45、CD90是abcam公司的，CD34是santa cruz 公司，CD105是millipore公司的，二抗是FITC及PE标记的，是北京奥博森生物技术有限公司的8 F0 u% ~4 J: e8 Y# T

xiaoyurly

不知道抗体的特异性怎么样，是专门抗大鼠的吗？流式抗体一般要求比较专一
% L" ]5 q/ {3 o" A' }最好分开染，染色时细胞计个数，一般抗体1ul大概能染10^6左右，流式检测有2-5×10^5就挺多了，另染色时控制体积在50ul左右，别太大，孵育过程中隔段时间轻弹管壁混一下

湖南干细胞

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我的细胞养了几代了都没有做鉴定，怕细胞不纯，做出的结果不好。你的第几代？5 N; l+ T% K" m" B  R/ i

飞翔的十字架

abcom的抗体应该没有问题，santa的看运气，加抗体后孵育最好放摇床上，有利于抗体结合
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还有，第一代不需要做鉴定，一般不会拿P1做实验的，我P2，P3都很纯，没区别

叮铃叮铃

学习

李兰兰

回复 飞翔的十字架 的帖子! b3 B$ j: k) V  ?% f
' V8 w. L' |  M* n: @
你们孵育是室温么？  一抗i和二抗一般加多少量

飞翔的十字架

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) [8 j: z$ C" G  N0 M! q
4度孵育，二抗一般一微升足够，一抗看说明书

sjlzw

第一代不纯，一般选3-5代吧

以诚相待

你是四个一起标记的吗？抗体浓度？多标的时候浓度应该比单标高点，再有你可以单标试试怎么样？细胞得代数最好在3-5代 希望实验顺利