人骨髓间充质干细胞体外纯化及心肌样细胞定向诱导分化后的特征分析 - 国内文献区干细胞之家



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发表于 2009-3-3 12:29 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

作者：马健唐海沁  翟志敏　朱薇波　李结华作者单位：安徽医科大学第一附属医院老年心血管科，安徽合肥 230022 4 w; _- l9 Y. h: U, a( n* H6 Y

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      【摘要】  目的在体外将人骨髓间充质干细胞（hMSCs）进行纯化、扩增及向心肌样细胞定向诱导分化，并对诱导后的细胞进行心肌样细胞相关特性分析。  方法采用体外纯化、扩增后的第4代hMSCs在体外经5 μmol/L 5杂氮胞苷诱导24 h后继续培养8 w，相差显微镜下观察细胞形态变化，免疫组化方法鉴定心肌特异性蛋白心房钠尿肽（ANP）和连接蛋白（CX43）的表达，流式细胞仪检测诱导前后细胞表面抗原（CD31、CD34、CD45、CD90）的表达情况，应用RTPCR技术分析肌球蛋白重链（βMHC）和肌钙蛋白T（cTnT）等相关基因在分化过程中的动态表达。结果 hMSCs诱导前为纺锤形，诱导后第2天部分细胞即开始发生形变，呈球形或短棒状，1 w后胞浆中颗粒增多，约20%～30%细胞呈毛T基因分别在诱导后第1周和第4周时表达开始增强，在第6周时均达到高峰，第8周时表达开始衰减。结论　hMSCs在体外经纯化、扩增和诱导后可表现心肌样细胞的生物学特性，可为hMSCs临床移植治疗提供可靠、安全的细胞来源。
      【关键词】骨髓间充质干细胞；诱导；分化；心肌样细胞
   　　自体骨髓干细胞移植治疗心肌梗死是近年提出的一个新的治疗模式。间充质干细胞（MSCs）在一定条件下还具有分化为成骨细胞、平滑肌细胞、血管内皮细胞等多种组织细胞的潜能〔1〕。MSCs具有组织非特异性的免疫调节、免疫抑制及易于体外扩增的特点，因此在修复损伤组织方面有很大的临床应用潜力，目前虽有少数临床应用的报道〔2，3〕，但要将该项技术作为常规治疗手段在临床广泛应用则必须进行深入的系统性基础实验研究，目前对MSCs在体外诱导分化为心肌样细胞的机制鲜见报道，特别是对人MSCs（hMSCs）纯化、扩增及诱导过程中心肌样细胞生物特征变化分析的研究甚少。本实验旨在探讨hMSCs体外纯化、扩增和诱导后心肌样细胞生物学特性，为临床应用hMSCs移植治疗提供实验依据。" Q) r% `7 X1 d! E- ~2 z7 T+ E

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　1 材料与方法

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　11 材料与主要试剂
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低糖达乐伯克改良必需基本培养基（DMEM,Gibco公司）；胎牛血清（FBS,Hyclone公司）；Ficoll分离液（密度 1063 g/ml,Sigma公司）；5杂氮胞苷（5Aza,Sigma公司）；兔抗人心房尿钠肽（ANP）、连接蛋白（CX43）IgG多克隆抗体(Santa Cruz公司)；荧光标记小鼠抗人单抗CD34PE、CD31PE、CD45FITC、CD90FITC及同型阴性对照MsIgGPE、MsIgGFITC（Becton Dikinson公司）；二步法免疫组化检测试剂盒（Polymer detection systerm for immunohistological staining,Sp9000 polyHRP antimouse/rabbit IgG detection systerm,北京中杉金桥生物技术有限公司）；逆转录聚合酶链反应（RTPCR）所需试剂均购自于Promega公司，RTPCR所需引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物有肌球蛋白重链（βMHC）和肌钙蛋白T（cTnT）。

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12 方法( }9 T7 B. t  ~, j$ {" p7 Y9 w$ Y
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121 hMSCs的分离、传代培养; n+ Z' h3 {5 K% f( ]3 }
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无菌条件下收集心胸外科手术过程中患者胸骨截面溢出的骨髓（5 ml，用肝素抗凝）以无血清的DMEM按1∶1比例稀释混匀，1 000 r/min离心10 min，弃上清后缓慢加入Ficoll分离液，继续离心30 min，用吸管小心吸取分层液面的絮状物，此层分层液富含单个核细胞，细胞经洗涤、计数后接种于培养瓶及6孔板中（孔中预置已消毒的盖玻片以备细胞爬片生长），放置37℃5%CO2饱和湿度的培养箱中培养，以后每2～3 d更换培养基1次，接近融合（密度为80%～90%）时用025%的胰酶进行消化，调整细胞密度以1∶2比例传代，定期镜下观察细胞形态及生长情况并拍照。9 h. e2 l3 `, x
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122 体外定向诱导hMSCs分化为心肌样细胞+ P5 I5 d" |$ m" ]- Y
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hMSCs传至第4代时以胰酶消化调整细胞密度为1105/ml悬液，分为标准浓度诱导组和对照组，分别用5 μmol/L 5Aza和不含5Aza的无血清DMEM混匀，温箱中孵育24 h后用含10鸖的DMEM换液，继续培养至第8周，每组包括30个细胞爬片。
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123 体外分化的心肌样细胞鉴定4 |$ \5 v4 m& i% H. S/ |
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1231 hMSCs的形态学观察
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细胞在诱导后定期镜下观察其形态、胞浆颗粒及细微结构。, k. B7 B( H% v/ [0 l. S8 d# l
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1232 hMSCs表面抗原的检测

在hMSCs传至第2代及诱导后第4周时收集细胞，胰酶消化制成细胞悬液，分别加入小鼠抗人单克隆抗体（CD34PE、CD31PE、CD45FITC、CD90FITC、MsIgGPE、MsIgGFITC），避光孵育20 min，用生理盐水调整样本量至500 μl，标记后的细胞在流式细胞仪（Becton Dikinson公司）进行分析。1 |  v( R0 I. \, r; G; I& p8 G

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1233免疫组化鉴定

收集对照组和诱导组诱导后第2、3、4周的细胞爬片， 4%多聚甲醛室温固定，加入3%H2O2阻断内源性过氧化物酶，分别加入待测的一抗（ANP、CX43多克隆抗体），4℃过夜，加入生物素标记的二抗（SP9000，羊抗兔IgG），常温孵育10 min， DAB显色（镜下控制显色时间），苏木素复染，中性树胶封固。实验中用PBS代替一抗作阴性对照。细胞在免疫组化染色后镜下随机数取非重叠10个视野计算阳性细胞的比例，根据染色强度进行分级：-、、、。3 @# O, y/ c6 w1 Z# {
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1234 RTPCR检测心肌细胞特异性蛋白mRNA（βMHC、CTNT）的表达
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取第2代和诱导后第1、2、3、4、6、8周细胞，计数约1106个，Trizol法提取总RNA，测定OD值计算RNA纯度，逆转录反应总体积20 μl，37℃水浴过夜。PCR反应体系20 μl，循环参数为：预变性94℃ 2 min，变性94℃30 s，1 min退火（βMHC和内参照GAPDH退火温度为60℃，cTnT为65℃），72℃延伸，共进行35个循环，最后延伸72℃ 10 min。取PCR产物在15%琼脂糖凝胶中进行电泳，珠海黑马图像分析仪进行灰度扫描，读取各带的吸光度值（A值），结果以AβMHC/AGAPDH、AcTnT/AGAPDH进行半定量分析。PCR所需引物见表1。表1RTPCR引物序列（略）7 g" |& l$ n+ u8 g) H/ {8 q/ P3 P
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13统计学处理

正态分布资料以x±s表示，应用SPSS100软件包进行统计分析，参数资料采用ANOVA检验。* |; ^7 W; \7 R, O$ G/ E# @
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　2 结果8 P- v8 q1 S4 H2 U& {4 f7 w

21 hMSCs的分离、培养、诱导及其形态观察
  Q! ?! Z$ B! v# K0 n# u/ c4 w
单个核细胞层用含10鸖的DMEM 培养2 d后培养瓶底逐渐出现贴壁细胞，呈圆形或长梭形（图1A），72～96 h后换液可去除大部分未贴壁细胞，原代培养5～7 d后细胞呈克隆性生长，细胞形态均一，为纺锤形，培养10～14 d时细胞生长接近融合，排列呈放射状或旋涡状（图1B）。hMSCs在诱导24 h后细胞由梭形变为球形，胞膜上有刺样突起（图1C），培养1 w后细胞多紧密平行排列，细胞体积增大，多数细胞呈短棒状，细胞边缘呈毛刺样，核/浆比例降低，胞核周围出现细小的颗粒样物质，约20%～30%的细胞胞浆中可见肌丝样结构（图1D）。同期对照未经诱导的细胞未出现上述变化。
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22 心肌样细胞免疫组化鉴定

诱导后2 w部分细胞就表现为ANP和CX43阳性（图1E、F），表现为细胞浆被染成棕黄色或深棕色，阳性细胞多呈短棒状，并行排列，ANP和CX43的表达随诱导后的培养时间而递增，诱导后第5周时ANP、CX43阳性率较第2周明显增高，差异有显著意义（P＜001），而对照组（未经诱导）则无阳性表达（表2）。表2 各期hMSC的ANP及CX43免疫组化指标的变化(略)! e, p9 D& u/ t8 B$ L" |" ?

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23 hMSCs表面抗原检测

未经诱导的hMSCs CD31、CD34、CD45分子表达均为阴性，CD90为弱阳性，诱导后第2、4周CD31、CD34、CD45表达依然为阴性，但CD90表达增加(图2)，且与未诱导组比较差异显著（P＜005）（表3）。

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24心肌样细胞βMHC、cTnT的mRNA表达( n+ o. |8 w# v, @1 z- d# e

未诱导及诱导后1 w的hMSCs均未见βMHC、cTnT的mRNA表达，βMHC的mRNA自诱导后第2周开始出现，诱导后2～6 w期间mRNA表达量随时间而递增，第8周时βMHC的mRNA表达量开始下降，cTnT的mRNA表达自第4周开始出现，表达时间较βMHC晚，第8周时亦出现表达降低（图3）。表3不同时期hMSCs表面抗原表达的变化(略)# S- W% ?3 O! R. w- W6 d
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3讨论! ~/ P" J  p; s9 s

　　各种原因所致心肌损伤的共同特点是心肌细胞数量相对或绝对减少，因此细胞替代治疗成为心血管疾病的研究热点，hMSCs和心肌细胞均起源于早期中胚层，在间叶细胞衍化组织形成及修复过程中hMSCs具有向该类组织定向趋化的能力〔4〕。因此，hMSCs既具有干细胞的特性又具有明显的可塑性，在体外具有诱导分化的潜能。

人骨髓中MSCs的含量少，故体外纯化及扩增对于hMSCs走向临床应用意义重大，研究表明hMSCs中约10%处于S、G、M期，G0、G1期占整个细胞群的比例达90%，说明hMSCs具有高度的扩增和分化潜能，但在传代培养开始阶段细胞常未能得到纯化，诱导成功率较低，此阶段将细胞用于移植难以获得较好的临床效果，另外，Fantini〔5〕、Park〔6〕、Rubio〔7〕等在体外实验中还发现非纯化的干细胞在诱导后易发生细胞凋亡及形成肿瘤细胞之虞。国内其他实验中的诱导分化率在30%～40%左右（细胞一般自第2代开始诱导），本实验中细胞诱导均从第4至第6代开始诱导（实验中流式细胞仪检测结果表明hMSCs在第4～6代时细胞纯化度明显增高），ANP、CX43免疫组化结果提示分化率可达到70%左右，高于以往文献报道，因此选用纯化度高的hMSCs进行诱导可以提高分化率和安全性。

　　为探讨hMSCs向心肌样细胞分化不同阶段的生物特征表达，实验从形态学、蛋白和基因表达以及生理功能等多个层面对诱导后的细胞进行心肌样细胞生物学特性分析。ANP是具有生理功能的心肌细胞分泌的特异性蛋白， CX43是心肌细胞缝隙连接的特征性蛋白，而心肌细胞的缝隙连接是心脏电生理一致性的物质结构基础，故选用ANP和CX43可以从功能和整体上鉴定hMSCs向心肌细胞的转化；βMHC是肌小节粗肌丝的重要组成部分，cTnT具有独特的氨基酸序列，均为特异性的心肌标志物，实验采用RTPCR技术检测βMHC、cTnT的mRNA表达，从基因水平上证实hMSCs可以向心肌样细胞分化，βMHC自诱导后1 w开始表达，而cTnT表达较晚（自诱导后4 w方才表达），二者在诱导后第8周时表达均下降，其机制考虑为hMSCs经诱导后凋亡相关基因亦被激活，随着培养的时间延长细胞凋亡影响各种心肌特异性蛋白的表达，综合免疫组化和RTPCR结果可以看出：hMSCs经诱导后并非呈永生性，为提高细胞移植的有效性和安全性，需在诱导后产生最佳分化/凋亡比率时收集细胞，实验数据显示诱导后6～7 w为最佳时机，此时hMSCs心肌特异性指标的表达均达到峰值且细胞在电生理功能上可表现为全细胞产生去极化和不成熟的复极化过程（膜片钳数据拟另文发表），表明hMSCs已分化为初具生理功能的心肌样细胞；CD34、CD45是造血细胞相关抗原，CD90为内皮细胞相关抗原，未诱导的hMSCsCD34、CD45均阴性表达，CD90弱阳性表达，经诱导后CD90表达呈上升趋势，表明hMSCs开始向血管源性细胞分化，但由于仅有5Aza诱导，诱导后的细胞未见内皮细胞标记物的表达，由此可见5Aza是定向诱导hMSCs分化为心肌样细胞的有效化学制剂。5Aza是胞苷类似物，具有脱甲基效应，而DNA甲基化水平与基因表达调控有关〔8〕，其诱导hMSCs心肌细胞化的可能机制是它控制特定调控基因上阻遏蛋白去甲基化而发生构型变化从而促进细胞分化，NKx25、GATA4、MEF2可与βMHC、cTnT结构基因的启动子结合，5Aza促进前三者的表达，进而促进了心肌细胞结构蛋白的表达，使hMSCs向心肌样细胞分化。: {6 H8 }2 @) x5 W) u
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hMSCs具有取材方便、自体回输无免疫排异、易于被外源基因转染且稳定表达等优点，是细胞心肌移植的良好供体，也为基因治疗提供了可能。作者认为，在体外纯化、扩增、诱导形成心肌样细胞特性稳定表达的细胞株可为hMSCs移植治疗提供优质可靠的细胞来源，而且采用5Aza诱导hMSCs分化为研究心肌样细胞分化的调控机制提供了良好模型，在此基础上可进行进一步的深入研究，为hMSCs经诱导后心肌移植的长期疗效和安全性如何、hMSCs向心肌细胞转化的本质和能力、何种诱导方案可以产生最佳分化/凋亡比率等问题提供实验参考依据，为hMSCs移植后远期疗效及副作用观察建立技术平台。
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