骨髓间充质干细胞分化的成骨细胞支持脐血造血干祖细胞的研究

文献管理员

作者：黄晓兵，刘霆，孟文彤，智伟作者单位：四川大学华西医院血液科，血液病研究室，  1干细胞与组织工程实验室，成都  610041
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          【摘要】  本研究利用骨髓间充质干细胞诱导分化的成骨细胞构建二维培养体系，探讨其体外支持脐血干/祖细胞生存的作用。体外进行人骨髓间充质干细胞（MSC）原代培养后诱导为成骨细胞，构建二维培养体系。将免疫磁珠分选的CD34 脐血干/祖细胞接种于其中，在无外源性细胞因子情况下进行体外培养，进行CFU，HPP-CFU和LTC-IC测定并将其分别与MSC、成骨细胞，MSC/成骨细胞（1∶2）作为饲养细胞的二维培养体系实验结果相比较。 结果发现：在所构建的造血干/祖细胞（HSPC）二维培养体系中，骨髓MSC诱导成骨细胞对于脐血造血干/祖细胞培养的支持作用显著优于其他各组培养体系，尤其对长期造血干细胞（long term-HSC）体外生存有更为明显地支持作用。结论：骨髓间充质干细胞诱导成骨细胞构建的二维体系对于脐血干/祖细胞体外培养具有支持作用，进一步证实成骨细胞对造血干细胞生存与增殖具有重要调控作用。 ) l6 L; w2 n, ]1 `
          【关键词】骨髓间充质干细胞' p, B2 q. w3 q# K# X6 [7 n6 _
                  　　Osteoblasts Differentiated from Human Marrow Bone Mesen-chymal Stem Cells Support Hematopoietic Stem/Progenitor Cells from Umbilical Cord Blood
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) Q0 k  m/ \1 @$ x7 O. v　　HUANG Xiao-Bing，LIU Ting，MENG Wen-Tong，ZHI Wei. G/ O9 ?) k+ u* C! V* `, m

1 ?  ?( e, g- B+ V% j: P　　Department of Hematology，Hematology Research Laboratory，1Laboratory of Stem Cells and Tissue Engineering，West China Hospital，Sichuan University，Chengdu 610041，China
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　　AbstractThis study was aimed to construct a two-demensional culture system by usingosteoblasts induced from human marrow mesenchymal stem cells (MSC) and to investigate itssupporteffect onsurvival of hematopoietic stem/progenitor cells for umbilical cord blood (UCB) ex vivo.MSCs were isolated from adult human bone marrow and were cultured，the second generation of MSCs were induced into osteoblasts which wereirradiated with 20 Gy gamma rays in a Cobalt 60 source and confluenced into a feeder layer. CD34  cells were selected from fresh umbilical cord blood samples by using Microbead Kit of MiniMACS and seeded into the two-dimensional culture system to culture ex vivo without exogenous cytokines. Byusing colony-forming assay，high proliferative potential colony-formingcell assay，and long-term culture initiating cell assay，the ability of the two-dimensional system to culture HSCs/HPCs was observed.The results showed that the osteoblasts induced from bone marrow MSC in constructed two-demensional culture systemdisplayed more significant support effect on survival of hematopoietic stem/progenitor cells from umbilical cord blood (UCB) ex vivo，compared with other culture systems，especially on long term HSCs survival ex vivo.It is concluded that the two-dimensional culture system constituted by osteoblasts induced from human MSCs has certain abilityof supporting maintenance and multipotency of HSCs/HPCs from umbilical cord blood in vitro，especially sustaining survival of HSC in long-term culture. It has also been proved that osteoblasts play a crucial role in regulation of HSC growth., H# d/ D5 u# h& P+ z: z+ c5 S

) L* b: Y$ ]2 `# X# e! `　Key wordsmarrow mesenchymal stem cell; osteoblast;hematopoietic stem/progenitor cell;two-dimensional culture system;cord blood( u5 \4 c6 G0 ?/ W" w# ~

" m1 c) z. H& z, f3 E' x( w. K长期以来，造血微环境被认为只是由网状细胞、成纤维细胞、血窦内皮细胞、巨噬细胞、脂肪细胞及细胞外基质等构成。近年来的研究充分证明，骨髓中成骨细胞是构成造血生态位区的主要成分，对于造血干/祖细胞的生存、增殖和分化起着关键性调控作用［1-5］。我们以骨髓间充质干细胞体外诱导的成骨细胞为饲养细胞构建的二维培养体系，在无外源性细胞因子情况下，对脐血造血干/祖细胞（HSPC）的体外支持作用进行了初步探讨。
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　　材料和方法, }1 [$ A2 C! G7 E& e. k
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　　实验分组
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: r7 o; b* n, }/ y　　共分为4组：A组为MSCs细胞层 HSC；B组为成骨细胞层 HSC；C组为MSC/成骨细胞层 HSC；D组为MSC诱导成骨细胞层  HSC。实验中细胞层平铺于12孔板中，每组接种6个孔。设定接种HSC后第1、3周为观测点。& Y+ L% u5 p' K9 C5 X% ^  S2 v
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　　骨髓间充质干细胞（MSC）体外培养和鉴定
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  r  l* D6 y6 W; d1 Y1 D* O　　在无菌条件下，从健康自愿者（35-40岁）髂后上棘穿刺，抗凝抽取骨髓15 ml，按参考文献［6，7］进行间充质干细胞的分离和培养。对MSC采用倒置显微镜观察细胞生长形态，流式细胞术（FCM）检测CD29，CD44，CD45等细胞表型（试剂购自Becton Dickinson公司）进行鉴定。, V( z: a0 _) r: b2 ]( C

  }+ h  u4 [" d　　MSC诱导分化为成骨细胞及其鉴定
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　　MSC诱导分化6 g3 ^: E9 X" S6 i

: |  ]% m! ^: p7 w# s" V$ e; i9 M　将第三代MSC以1104/cm密度接种在75 cm塑料培养瓶和24孔板（内含预处理的小玻片）中，仍给予DMEM完全培养液培养，48小时首次换液后，培养液换DMEM完全培养基   地塞米松10-8mol/L   抗坏血酸50 μg/ml   β-甘油磷酸钠10 mmol/L   bFGF 5 ng/ml，每2天换液1次(地塞米松、抗坏血酸、β-甘油磷酸钠、bFGF购自晶美公司)。
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- r1 t0 @* @$ e/ s　　诱导的成骨细胞鉴定
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　　① ALP检测： 95%酒精固定15分钟，采用钴-钙法染色；② I型胶原蛋白检测：10%中性福尔马林溶液固定30分钟，做免疫组织化学FITC标记；③ 骨钙素检测：4%多聚甲醛固定30分钟，做免疫组织化学罗丹明标记；④ 诱导钙结节的生成，诱导后第21天茜素红染色。
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　　人同种异体成骨细胞的培养和鉴定
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　　取意外流产死胎(由四川大学华西第二医院提供，遵循自愿和知情同意原则，符合医学伦理的有关要求)头盖骨骨膜，参考文献［8］进行成骨细胞原代培养，并连续传2-3代。成骨细胞的鉴定同上。7 L& c& j' A( j+ }4 ^$ k( |, _
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　　二维培养体系的建立2 F& E; E4 |* \# C: G6 h

  M# h8 q3 o3 B; C　　A、B、C、D组中，利用胰蛋白酶消化，用DMEM培养液将MSC、成骨细胞，MSC/成骨细胞（1∶2）和MSC诱导的成骨样细胞制成5104/ml的细胞悬液，钴60照射(20 Gy)后，接种在12孔板上，每组6个孔。A组加入DMEM完全培养液，B组加入F12完全培养液，C和D组加入DMEM/F12培养液，每3天换液1次。
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　　人脐带血造血干/祖细胞分离、纯化和接种+ c- r& {3 Q7 n3 A1 M4 e  W

2 E& I1 O' r& H' l1 _* _9 b　　采用足月分娩死胎儿的脐血(由四川大学华西第二医院提供，符合医学伦理的有关要求，遵循自愿和知情同意原则)。Percoll液（比重1.077）密度梯度离心后免疫磁珠分离(CD34 细胞单克隆抗体免疫磁珠分离系统购自Miltenti Biotech公司)。收集CD34 细胞；用流式细胞术鉴定CD34 的纯度。$ e' g* t7 \7 p' h. D% s8 a, N" M

0 R4 [; ^3 o4 K/ Y. u. ~' q, i将分离纯化的脐带血异基因HSPC加入髓系完全培养液(购自R&D公司)，以1.8105/ml 直接接种于A、B、C、D组各孔饲养层上，在37℃、5%CO2 、饱和湿度条件下培养，每周半换液2次。+ _1 C* F, a/ N; n
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HSC接种后第1周、第3周，收集各组培养体系中细胞。A、B、C、D组首先通过轻轻冲洗，收集未黏附细胞，然后加入非胰蛋白酶细胞分离液（CDS购自Invitrogen公司），37℃孵育10分钟再收集细胞，将各组收集的细胞台盼蓝拒染实验并计数。$ Z5 d' O4 C) p1 E" u* p

% G' y! z. \+ H. ~　　各组培养体系支持HSC/HPC的观察3 [: O' B: v* ^

+ C3 Q; M* J+ ~* _　　显微镜观察倒置显微镜观察骨髓间充质干细胞、成骨细胞、骨髓间充质干细胞诱导成的成骨细胞的形态以及由以上细胞所构建的二维培养体系情况。
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/ `& E7 `- j% o& H. r6 W/ f　　脐血造血干细胞CFU和HPP-CFU实验, T8 u8 ]. [+ X  b) @9 l

+ u  y2 x% F3 a% n% O& S　　脐血CD34 细胞接种培养1周，3周后，进行造血祖细胞集落分析（CFU和HPP-CFU），以反映晚期和早期HPC的增殖和分化。采用甲基纤维素完全培养基（甲基纤维素-IMDM 1.3%，胎牛血清25%，牛血清白蛋白1%，L-谷氨酰胺2mmol/L，2-巯基乙醇510-5mol/L；加人重组细胞因子SCF 50 ng/ml，GM-CSF 10 ng/ml，IL-3 10 ng/ml，EPO 3 U/ml购自Stem Cell公司），均匀与每孔消化下来的细胞混合，接种于12孔培养板中，每孔1.5 ml，复种2孔。置于5% CO2及饱和湿度的培养箱中培养28天，第14、第21天计数CFU-GM，BFU-E，CFU-GEMM。第28天计数HPP-CFU（直径0.5 mm，细胞数50 000的高密度大集落）。
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　　脐血造血干细胞的LTC-IC实验  b; Q9 q/ e" X+ {' E' j

/ L) h% }1 p2 L( G　　培养1周，3周后进行LTC-IC分析，以反映HSC和早期HPC的增殖情况。用于该分析的滋养基质细胞为受20Gy照射的正常人骨髓基质细胞，搜集每孔消化下来的细胞与Dexter长期骨髓培养液混合，接种于已铺被基质细胞层的12孔板，2 ml/well，每周半量换液1次，培养5-8周后用2.5g/L胰蛋白酶-EDTA消化，收集的细胞洗涤1次，按上述作集落培养，第14天计数所有集落，即为LTC-IC。微量移液枪吸取1个集落涂片后Wright-Giemsa染色。3 n% r( Y0 i! \" W+ O
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　　统计学处理
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* v- z" q$ \. R# n+ h6 A1 B　　应用SPSS 11.5软件进行统计分析。实验结果的数据用x±SD软件进行表示，两组间比较采用t检验。当P6 }& f3 n0 \- [; }0 D5 a

( o9 z6 K' [+ x; D- h　　结果
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5 y3 R  H5 J6 t- E　　人骨髓间充质干细胞、骨膜成骨细胞培养9 P3 _7 r+ }( V

& I) s( a; @0 x; t" U+ H, l　　根据文献方法分别进行了人骨髓间充质干细胞和骨膜成骨细胞原代培养，结果细胞呈克隆样生长。当细胞密度达80%时，进行传代培养。培养的MSC和osteoblast的形态见图1。
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" L8 b: ]' @3 W8 a- e　　人骨髓间充质干细胞诱导成骨细胞- K; T6 D$ E& E. u

7 L5 I* m( C- D. s4 Z/ A　　当骨髓间充质干细胞传至第2或3代时，将部分细胞向成骨细胞诱导。诱导第8天时钙-钴法染色测ALP，可见85%细胞胞浆中有大量灰褐色颗粒；诱导第10天 I型胶原蛋白免疫组织化学FITC标记，可见70%细胞浆不同程度的表达绿色荧光；诱导第14天骨钙素免疫组织化学罗丹明标记，可见80%细胞浆不同程度的表达红色荧光；诱导第21天茜素红染色可见在细胞聚集的部位出现红色钙结节（图2）。
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! H; {2 s- o+ N0 U1 ]　　二维培养体系的建立及脐血造血干细胞接种
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　　骨髓间充质干细胞、成骨细胞、骨髓间充质干细胞诱导成的成骨细胞接种在孔板后第7天，利用倒置显微镜观察二维培养体系的生长情况。脐血通过MiniMACS免疫磁珠阳性分选获得CD34 细胞，流式细胞检测其纯度达80%。接种于二维培养体系中培养。培养1周和3周的成骨细胞见图3。/ M5 s. p% A+ d

4 S: Y; y4 k  ]- O1 |6 W0 {8 t# r　　培养1周后造血祖细胞集落与LTC-IC分析
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　　无外源性细胞因子作用下，脐血造血干细胞在二维培养体系中培养7天后，进行造血祖细胞集落实验。各组间的CFU-C和HPP-CFC比较无显著性差异(P>0.05)；而D组LTC-IC与其他各组间比较差异显著(P
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　培养3周后造血祖细胞集落与LTC-IC分析
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　　无外源性细胞因子作用下，脐血干细胞在二维培养体系中培养21天后，进行造血祖细胞集落实验。比较各组CFU-C可见，D组较其他3组有显著差异(P
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　　讨论
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9 Q! q6 k! B6 ^5 p; \　　造血生态位区（hematopoietic niche）是由骨髓内能容纳一个或更多的造血干细胞、并调控其自我更新和分化的组织细胞亚群和细胞外物质构成的结构单位［8］。成骨细胞是造血生态位区的主要构成成分，并对HSC的生存、增殖和分化起着关键性调控作用。这种作用主要表现在：胚胎发育晚期，成骨细胞成熟障碍将导致骨髓造血的缺乏；成骨细胞可以表达许多与造血调控相关的细胞因子，如G-CSF、GM-CSF、M-CSF、IL-6、IL-7、LIF、TNF、VEGF等；成骨细胞的骨形态发生蛋白（BMP）受体IA参与造血调控的信号传导通路；成骨细胞通过分泌Notch配体Jagged1，活化HSC 中Notch1信号通路，促进HSC的增殖。外源性PTH通过成骨细胞的甲状旁腺激素（PTH）受体（PPR）引起成骨细胞增殖，相应的HSC数目增多; 骨髓成骨细胞可募集宿主循环中的HSC，促进归巢，重建造血，同时HSC促进成骨细胞分泌IL-6，MIP 和其他因子，有助于HSC移植后微环境的形成。 在动物模型中，通过转基因技术阻碍成骨细胞的发育成熟，则相应骨髓造血也受到抑制。在小鼠异基因HSC移植实验中，供者小鼠的成骨细胞联合输注，可明显减少GVHD的发生，有助于受者小鼠的长期存活。骨髓间充质干细胞也是构成造血生态位区的重要成分，这不仅因为它可以分化为成骨细胞、脂肪细胞、内皮细胞等其他构成造血微环境的细胞成分，而且它本身也对造血干细胞的增殖分化进行调控 ［8-12］ 。本研究采用地塞米松、抗坏血酸、β-甘油磷酸钠和bFGF联合诱导MSC向成骨细胞分化，利用骨髓间充质干细胞及其诱导的成骨细胞在体外构建造血干细胞二维培养体系，在无外源性细胞因子的参与下，由骨髓间充质干细胞、骨膜成骨细胞及间充质干细胞诱导成的成骨细胞等饲养细胞分泌的相关因子，支持了脐血干/祖细胞体外培养［14］，同时避免了外源性细胞因子促进造血干细胞分化作用，维持了造血干细胞的生存。' p0 A& W& A7 k3 u. w

+ f3 M: q: _( u& D, J4 X' v5 u我们所构建的造血干细胞二维培养体系中，成骨细胞对于造血干/祖细胞培养的支持作用显著优于无成骨细胞培养体系，其中骨髓MSC诱导成骨细胞对于造血干/祖细胞培养的支持作用显著优于其他各组培养体系，对于早期造血干细胞体外生存有更为明显地支持作用，这说明该组培养体系更接近于体内造血生态位区中成骨细胞的发生和二者间的比例构成。此外，在MSC向成骨细胞逐渐分化过程中存在有不同分化阶段的成骨前体细胞，它们对造血干/祖细胞体外培养可能具有不同的调节作用，这已经在最近的相关研究中得到了证实［13-15］。0 ~. z9 I5 v* V& C3 ?7 R

+ ]2 g! m& @/ R0 Y) I; I, o5 A  A本研究有别于其他有关成骨细胞对造血调控的研究方法，采用体外骨髓间充质干细胞诱导成骨细胞作为饲养细胞，观察其在无外源细胞因子的参与下对造血干细胞的支持作用，排除了体内微环境其他细胞成分和因素对造血的影响，其结果进一步证明了成骨细胞对造血调控的关键性作用和对造血干/祖细胞体外培养的支持作用。本研究的结论对于脐血造血干细胞体外培养提供了新的思路。- X/ \% s- f) i, F7 S. y

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sky蓝

初来乍到，请多多关照。。。嘿嘿，回个贴表明我来过。  

beautylive

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命运的宠儿

做对的事情比把事情做对重要。  

我心飞翔

说的不错  

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怎么就没人拜我为偶像那?? ~  

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挺好啊  

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我心飞翔

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