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作者：邬伟，杨景全，陈松芳，王小同，郑国庆，张昱作者单位：温州医学院第二附属医院，浙江 温州 325027 . W4 ^) Q% z$ K. f1 y- O
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* o" M' n4 K" O1 h6 X) @ 【摘要】 目的: 探讨骨髓间充质干细胞（BMSCs）对阿尔茨海默病（AD）大鼠空间学习记忆能力的影响。方法: 雄性Wistar大鼠45只，随机分为假手术对照组（SOC组）、双侧FF切断模型组（模型组）和骨髓间充质干细胞移植治疗组（治疗组）。用Morris水迷宫检测各组动物逃避潜伏期。结果: 与对照组相比，模型组大鼠逃避潜伏期明显延长（P
5 f* M& O ?# U# j Y 【关键词】阿尔茨海默病；骨髓间充质干细胞；迷宫学习；记忆障碍
7 L+ b* Q2 [! @* J$ f" Q! _+ z Effect of bone marrow mesenchymal stem cells on spacial learning-memory ability in dementia model ratsWU Wei*，YANG Jing-quan，CHEN Song-fang，WANG Xiao-tong，ZHENG Guo-qing，ZHANG Yu. *Department of Neurology，the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College，Wenzhou，325027
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$ w0 q' o" H/ `# RAbstract:Objective: To investigate the effect of bone marrow mesenchymal stem cells on spacial learning-memory ability in dementia model rats. Methods: Forty-five male Wistar rats were randomly divided into the sham operation contrast group (SOC group)， the FF lesioned group (model group) and the BMSCs treatment group. Their escaping latency was evaluated by Morris water maze. Results: The escaping latency of model group was significantly prolonger than that of the SOC group (P M6 [: r; ]/ K: v% a5 ]4 y/ D% x
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Key words:Alzheimer disease；bone marrow mesenchymal stem cells；maze learning；dysmnesia
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阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种以记忆力减退为特征的进行性中枢神经系统变性性疾病，至今尚无有效治疗方法。AD患者基底前脑胆碱能神经元约有90%丧失[1]，神经生物化学研究显示，AD患者乙酰胆碱（acetylcholine，Ach）合成减少，胆碱乙酰基转移酶（choline acetyl-transferase，ChAT）活性下降，且与痴呆严重程度密切相关。穹窿海马伞（hippocampal fimbria-fornix，FF）切断痴呆动物模型能够成功模拟AD胆碱能神经元缺失，本研究已经体外实验证实大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)可以跨胚层分化为神经元样细胞，此次研究将利用双侧FF切断造成AD动物模型，观察BMSCs对痴呆模型大鼠学习记忆能力的影响，期待为AD的治疗寻求更有效的方法。
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/ U4 r+ t* \' @7 W9 E3 R1材料和方法) x4 C2 z( t8 E' U9 O" X1 x
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1.1实验仪器及试剂大鼠脑立体定位仪（韩国），Morris水迷宫（中国医学科学院药物所制造）。
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3 H. m7 c5 Y }% c; y9 ]) @1.2实验动物分组Wistar雄性大鼠，鼠龄3～4个月，体重250～300 g，全部大鼠在正常温控光照及自由摄食条件下饲养。实验动物分组用水迷宫筛选反应迅速、活跃的Wistar雄性大鼠45只随机分成3组，即对照组（假手术对照组）、模型组（双侧FF切断模型组）和治疗组（双侧FF切断后行骨髓间充质干细胞移植治疗组），每组15只。" q% |' ^" s7 F% W- h* j
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1.3动物模型的建立雄性Wistar大鼠，用10%水合氯醛（3.0～3.5 ml/kg）腹腔麻醉后固定在立体定位仪上，常规消毒、剪毛，正中切开头皮，暴露出颅骨，参照Paxinos 和Watson 的大鼠脑立体定位图谱选取坐标，前囟后(AP)2.2 mm，中线外1.0 mm处，用电动开颅器钻开颅骨，切开硬脑膜，用自制双刃刀（宽2.0 mm、厚0.2 mm）先置于上述部位的脑表面，接着降刀4.5 mm，外移1.0 mm，然后再降刀1.0 mm，上下抽刀约20次，以保证完全切断FF。最后抽出刀片，注意无菌操作，清洁颅面，皮肤切开处给予少许青霉素粉剂，缝合头皮。假手术组除了不切断FF外，其余处理同上。所有实验动物都给予常规饲养。
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% p6 {) q" V) ?4 H/ e+ x. i" O1.4BMSCs的分离、培养、鉴定同文献[2]所述。
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1.5BMSCs的脑内移植治疗组在切断FF后2周行BMSCs移植。用10μl Hamilton 微量注射器，将BMSCs细胞悬液10μl（相当于1106个细胞）立体定位注入动物双侧海马，每侧移植细胞数为5105(体积5μl)，前囟后4.0 mm，中线旁开2.0 mm，硬膜下3.0 mm，按1μl/min 的速度匀速将细胞注入脑内，注射完后留针5 min。然后退出微量注射器，缝合皮肤切口。其余各组注入等量0.01 mmol/L PBS，操作同前。, v" g- u y; B+ k
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1.6学习、记忆能力的测定造模前、造模后2周、造模后6周（即治疗后1个月）采用 Morris 水迷宫进行学习、记忆能力的测定，以大鼠逃避潜伏期代表学习记忆能力，测定方法同文献[3]所述，逃避潜伏期越短，大鼠学习记忆能力越强。
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- x5 a) i% |# x' m1.7统计学处理方法采用SPSS 13.0 统计软件处理。组间差异用单因素方差分析，组间两两比较用最小差值显著法(LSD)进行统计分析。
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2结果+ F* Q! F8 \5 [2 m! I
3 C, w9 p W. ]1 [7 g) J①造模前各组大鼠逃避潜伏期比较：F =2.03，P＞0.05，说明造模前各组大鼠的学习记忆能力差异无显著性，有可比性。②造模后2周，模型组与治疗组比较差异无显著性（P＞0.05），两组分别与造模前比较差异有显著性（P＜0.05），说明FF切断造成大鼠中枢胆碱能系统损害，引起大鼠学习记忆能力下降，造模成功。③造模后6周（移植后）模型组与造模后2周相比，逃避潜伏期没有明显改变，差异无显著性（P＞0.05），说明随时间增加AD模型大鼠学习记忆能力没有好转，造模后6周的模型鼠可用于作为同期的模型对照。④移植后1个月（移植后）各组大鼠逃避潜伏期比较：治疗组与模型组相比，逃避潜伏期减少，差异有显著性（P＜0.05)，说明痴呆大鼠学习记忆能力有所改善。结果见表1。( E3 Z, q7 L- O- @6 C& W- w5 p
5 d* x6 B0 }, x0 Q- g0 ~3讨论
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* |# e. p6 C1 L7 K; `. m中枢胆碱能神经系统是构成学习记忆的重要生物学基础，脑内胆碱能神经系统的退变被认为是造成AD的最重要病理因素之一。该系统的胆碱能神经细胞胞体主要存在于内侧隔核（medial septum，MS）、Broca斜角带核及Meynert基底核等，其纤维投射到海马及大脑新皮质的广泛区域。这一投射与学习记忆和认知功能有着密切联系，在任何一个环节阻断或损坏这一投射系统都可导致动物认知障碍和学习记忆能力的损害[4]，根据损害方式的不同，可分为电损毁模型、外科损毁模型、化学损毁模型及免疫毒素损毁模型等。其中FF切断由于操作简单、经济有效，在干细胞移植治疗AD的研究中应用比较广泛。Blusztajn等[5]研究证实单侧FF切断1～2周后，损伤同侧MS胆碱能神经元较对侧减少50%～60%，斜角带垂直支（vertical diagonal band，VDB）约减少40%。同时，损伤侧海马内胆碱能纤维明显减少，迷宫测试显示该模型鼠的学习获取能力和记忆能力均较对照组明显下降。本实验采用双侧FF切断的方法建立大鼠AD模型，以确保由MS和VDB投射到海马的神经纤维完全损伤，希望更有效地模拟AD的胆碱能损害。Morris水迷宫是1981年由比利时科学家Morris发明的，是用来检测啮齿动物空间学习记忆能力的比较理想的实验系统。实验中的记忆相当于人类的近期记忆，在AD患者中这种近期记忆损害更严重。本实验采用Morris水迷宫了解治疗对AD大鼠学习记忆能力的影响，大鼠逃避潜伏期缩短说明大鼠的学习记忆障碍改善。对各组大鼠Morris水迷宫测试成绩统计学分析显示：模型组大鼠学习记忆能力与假手术对照组大鼠相比明显下降，证实了AD大鼠模型制作成功。BMSCs治疗后双侧FF切断大鼠的学习记忆能力明显改善。
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在国外，BMSCs移植己用于帕金森病(Parkinson’s disease，PD)、脑和脊髓损伤、脑卒中和中枢神经退行性疾病等治疗的实验研究[6-10]。发现移植后的BMSCs可以在中枢神经系统中存活、繁殖，并能迁移到不同部位甚至分化为该部位相应的神经系统组成细胞，同时发挥治疗疾病、修复损伤的作用。但是少见BMSCs治疗AD的相关报道，鉴于BMSCs容易获取、易于培养、免疫原性弱、能够在宿主体内广泛迁移等特性，本实验将BMSCs植入双侧FF切断的大鼠痴呆模型海马中，结果发现，胆碱能系统损伤大鼠的学习记忆能力得到部分改善。这种治疗作用究竟是通过何种机制得以实现，将在以后的研究中进一步明确。9 J7 \, r8 C+ p6 c! B- ~
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