请帮忙分析下RNA电泳结果

jiojoo

9 j; I" R" O. u5 U2 F) d# x4 V
提取了RNA，吸光曲线显示RNA非常纯( V; ], {9 |1 J. D- N' X+ }. o
但是电泳结果如图所示，感觉似乎降解的比较严重。
+ Q0 ?; ?1 Q/ F* P) d1 w: a我电泳用的是普通的1%琼脂糖凝胶，不是变性电泳4 k' i( r2 |9 n- I0 K  W7 I( T1 P' a
那些弥散状的东西是因为电泳不是非变性凝胶才产生的吗？
9 c  |* W8 g' c6 q最下面最亮的是5s还是降解的RNA碎片？
5 I1 v. i% ]1 I8 _  d

2011-12-4 21:53 上传

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! p; d$ }8 f- m7 g" @5 w

2011-12-4 21:53 上传

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1 K, T% H1 [8 C/ H
28s上面还有一条带，是基因组DNA吗？) s8 B/ _1 P8 v+ G6 t
之前好像记得哪里说过，实时定量PCR对RNA纯度要求很高，反而对RNA完整性要求不高。
& [) K( w' ]5 F如果只用来做实时定量PCR，这种降解程度是不是不会对结果产生影响的？6 u9 u; `: d5 L" p
忘各位前辈不吝指教

不倒翁

降解了不会有碎片的 还有 跑的时候电压调高 时间尽量短

linzi214

抽提RNA用的PBS、ddH2O都用DEPC浸泡过夜，高压预冷后用。枪头可以用DEPC水浸泡后高压或直接买DNase/RNase-free的枪头，在抽提过程中要戴口罩，带干净的乳胶手套，如果接触其他东西的话喷一下酒精。操作台面和加样枪用酒精消毒后再用。一般没有问题的

jiojoo

1 \9 \. [3 p* g, V& c/ v. [& C* K
回复 linzi214 的帖子& E+ r9 [9 ^- x; @
3 I* j$ `, k; i: O
感谢！; U0 o. J6 J: h! f7 `; c; P
我现在提取的RNA纯度是非常好，浓度也能满足需要
* H7 g8 R/ [; t! A% I# o& W只是降解性一直没得到很好的解决，我用的EP管和枪头都是AXYGEN的，说是无RNase的
  }+ ~6 T  s" Z: r! a) r& O我都是直接用，别人也这么用，也没出过问题7 @! l, k4 o3 c* L
有点不同的就是我的细胞量比较少，只有约20到30w
) C1 W% |* L$ i& m% T) D, d5 o, y$ ^) D
此外，最近又出现DNA污染的问题，不知哪些情况会导致DNA的污染？是Trizol裂解的时间不够吗？

linzi214

加入Trizol吹打混匀后室温放置5min，加入氯仿颠倒混匀至分层液体变为均匀的小的粉色油状颗粒，总之一句话充分混匀，然后静置10min至分层，离心。离心后转移上层清澈液体即RNA至一干净EP管中，注意不要吸到白色的中间层。一帮情况下这样做是OK的。你再试一下，宁缺毋滥，再保证RNA量的情况下，还要主要RNA的纯度。

jiojoo

回复 cronos0910 的帖子8 ^# R: [9 p9 N# J& S# o2 H1 |* B- a

# G9 K: }7 P  N9 R9 J) [4 V感谢回复) T) H+ G$ n, d* {3 O/ H
Trizol和Choloroform这步有什么问题会导致DNA污染呢？) ]8 M- v1 h/ T2 N. x
Trizol裂解时间不够？Choloroform加的过量或过少？
, q3 O6 w0 u' V6 I! Q还请指教; V5 U! j/ O! f, {- [& S- k
谢谢

linzi214

& c( T8 B2 A. H5 t; U
, \- r3 R% g$ X也可以将RNA和DNA电泳系统分开来用。RNA最好抽提定量后就先逆转录一批cDNA，然后保存在-80oC，这样不容易降解，逆转录为cDNA的样本更易保存。

linzi214

1.5%琼脂糖凝胶电泳10~15min就好，每个孔上样3~5ul RNA量，不要电泳太久。一般OD值测出来结果比较好的话，我们实验室只在第一次跑电泳鉴定抽提效果，后来直接做QRT，效果一样好，不过最好每次都电泳看一下

cronos0910

这样的RNA sample还是可以用来跑real time PCR，做之前建议加DNase，因为你的TRIzol跟choloroform那步没做好，有明显的DNA污染，另外如果你想要准确点的real time PCR的结果，可以在目标基因的5'跟3'都设primer，做double check，如果还有问题，欢迎提出来一起讨论

ielisa

RNA的完整性对实时定量的结果影响很大的，你的RNA降解很严重，应该是在操作过程中发生的降解，你是试剂盒抽提的，要么就是你一次抽提的样本多，时间间隔过长造成了降解，要么就是你进行试验时用的枪头啊，试剂啊含有RNA酶，建议试验开始前一定要做好准备工作。跑胶的浓度1%就可以了，跑胶的时间也不长，这个过程的降解微乎其微，不用变性电泳了。