急求:关于流式细胞仪对细胞表面抗原鉴定的问题

李兰兰

请教大家一下，我的染色步奏有没有问题？
6 s6 i  Y0 y) C" ?1、第一代大鼠骨髓间充质干细胞80%融合时，胰酶消化，含10%血清培养液进行终止，1000转，6min离心一次，然后加入ph7.4的PBS洗涤一次，加入0.5ml的PBS重悬细胞。
& O9 |& p) ]# h4 [& u2、加1微升的一抗CD34、CD45、CD90、CD105，冰上放置30min。! X. I: l0 K, \. c2 g' c4 D. }
3、加PBS洗涤2次，以0.5mlPBS重悬细胞，加入相应二抗1微升，湿冰避光放置30min。
: i8 ?( J0 w0 `& D) G4、加PBS洗涤3次，以0.5mlPBS重悬细胞，上机。
: {& K/ a+ ^4 w0 j5 w. K6 X) s- Q9 Y
5 \7 W7 Y; o+ D! r$ x; b- x/ d结果四种抗体及阴性对照的图基本上一样，结合率非常低，0.7%左右。
3 P. A4 }* x7 r4 R& g; Z# e请问各位应该是什么步奏有问题，应怎样改进。急求各位指点

michellejo

染色的时候最好在100ul的体系中，上流式前再稀释

以诚相待

回复 李兰兰 的帖子4 @( m3 |. M" ^$ w; O& W8 f  h
* o- q4 X3 b# \( Z( i
做什么细胞得呢？单标应该好做

13765021715

第一代不好，一般用第5代。

monk125

给你发个经验procotol这里一抗是荧光一抗，你看有没有问题，区别在于100ulPBS中孵育的

李兰兰

回复 以诚相待 的帖子6 i3 N9 d0 F6 t3 r  A

: Z% t+ G; y' e4 X我是单标的，希望下周做，可以顺利。

李兰兰

回复 evial 的帖子
! e( |0 D" u8 M  t3 b- ]$ t' M& n9 j
便宜一些
3 D3 y, ]$ }$ ~: U& |

wr7930

室温孵育就好，为什么用冰浴呢？

evial

为啥用一抗二抗？请用直标流式专用抗体，一抗二抗结合效价不够回答折啊

ciweiyuan

控制溶液体积在50-100ul，抗体加入后要混匀，同时你也可以做一下单标的对照