u6启动子的问题

hughliang

fguw 发表于 2011-8-16 02:24 ) c9 n1 M4 E4 q+ F( U) E5 X7 I/ u
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4 R5 h3 w& N9 |! {
. Z6 z3 t( D7 ?1 ~6 [" i1 q( ~可能是长时间后慢病毒失活了，所以，不再有KD，

9 Q' O" C# `* G/ W# z; {是有这个可能。
8 \5 n, v% G+ v" v9 @& l: F
. U7 ]8 O8 |% m. Q0 j0 o! h+ a1 i但流式证实转染细胞仍有荧光，我在想是否细胞能补偿干扰的作用。

hughliang

runsong 发表于 2011-8-16 12:23
$ x6 S5 Z: [7 u$ Z$ o" \0 v2 }回复 hughliang 的帖子8 g9 h" m0 [( N( g
* }6 H1 }+ i, T1 P8 A
十分感谢，你提供的线索太有价值了。

: x) W% ~: p- p5 a4 ]; q! f$ `) \不客气
: u# A; A4 G" u, U: i7 g3 \  _; Z, B1 B5 q8 Z- w
也分享两篇供参考
, z: p9 M( G! ?
, Y  I2 W: _, p, l祝实验顺利
5 ~& o; A0 o# _
& F! k% m. s4 i( a2 ?- r, H

fguw

回复 hughliang 的帖子0 n6 h7 _4 _+ _: _! i6 q
1 c$ g7 L, c# d' I, i
我觉得你做试验的细胞是多克隆？没有挑单克隆？4 B$ y; H9 B! Z- f" _7 V9 G1 ?
流式证实转染细胞仍有荧光，大概阳性细胞比例多少？
; u( R+ m5 O* x  K! A如果比例比较低，可能WB检测时更多的是非阳性细胞细胞（失活）信号。所以KD效果不好。
# L1 c9 r7 o) Q) w+ x还有，SHRNA 和GFP使用不同的PROMTOERS，可能在不同的LOCUS活性不一样，当然，我不太认同该观点。

hughliang

回复 fguw 的帖子0 W6 v1 m; n; S$ `

5 |# h/ W2 C# I* P0 U$ N$ D+ g是的，偷懒没挑单克隆。# [( \" K# `  `8 H' K/ ^" H& a
% ]: X" k% p2 `5 L
我一般流式分选或G418筛选，但没挑单克隆。
3 B. }) T# R8 H/ f
& n$ N$ o" W3 d) d7 l流式检测时带荧光细胞比例最低时约70%多，可能对干扰效应有影响。
+ `/ ?+ Z; n1 v5 @9 V4 Z$ H
; @, O' _! s# y* @, D. Y' |4 w5 E谢谢！

sarah19860420

回复 runsong 的帖子
" O* b& S/ f6 u/ {2 e9 }. W
5 b6 n2 m; i  D# x8 `您好，我现在也是想用PLL3.7做shRNA。然后之前看帖子有的人说要形成这样的一个结构forward oligo：酶切位点+G+siRNA+loop+reverse compliment sequence+TTTTT% V, i9 t/ A0 j& J9 v% X) h
reverse oligo：酶切位点+AAAAA+reverse sequence+loop+compliment sequence +C0 x5 |  [! q. t+ j0 M
' ]' b$ ]% z0 ~, X" ~1 D/ E
我想问的就是这个G点就是你们所说的U6转录起点的问题吧。那如果siRNA这个核心结构的开头就是以G开头的，还需要加G吗，你们的转录起点问题怎么解决的。我的载体是PLL3.7，酶切位点是Xho I，NOT I。能不能给我点建议。实验室没人弄过。所以想得到一个确定的答案。

w20043459

膜拜各位大神