实时定量PCR相对定量的一个问题

savid888

相对定量，只要扩增效率接近100%就可以了，没必要测浓度，当然浓度不能太离谱，否则扩增效率不可能近100%。) H, V4 [2 P$ C, }; i9 P
另外，DNA污染没事，需要引物跨内含子，或者DNase处理就可以了。

jefferson

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1 J' J! H7 O2 W9 G" O/ K直接的说, 如果这么做, 即便是相对定量, 其结果完全没有意义的.
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微量操作遍及分子细胞生物学的各个角落, 如果能凭目测对细胞进行定量评估用于相对定量的PCR分析, 简直....../ o& |8 W, @; o2 r  ?0 ]# ?
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如果不对RNA进行定量, 即使进行相对定量分析, 也作了内参进行校正, 在组内差异上, 由于逆转录时RNA量不同, 很可能就导致反转录效率不同; 反转录效率不同, 进一步进行定量PCR时效率也可能不同, 就是大家说的,用△△CT法分析结果, 要求扩增效率都必须是100%, 且不说你这个能达到都是100%, 组内扩增效率相等都达不到，用这种方法分析，有什么意义呢？
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- N* E( B6 e. y, |. U% o3 X起始的数据就是不均一的, 且不说组内的差异，退一步，认为组内差异能被忽略。 组间差异就不是那么容易忽略的了，定量结果需要至少三次独立重复实验结果进行统计分析，你能保证每次你目测的细胞量都和之前的实验细胞量基本相同？略有误差，包括你抽RNA时手法上的差异，导致RNA浓度不同，最终批次间的差异进行统计分析时， 本来有差异的表达很可能就会因为标准差很大而成为组间无差异，这样的结果， 不管最终的统计结果最终是有差异还是没差异，都没有任何参考价值的。完全可能是批次间的标准差不正常所导致的。
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8 A, H) S) G% a$ v; E- `/ z7 P欲速不达放哪里都适用，一时的便捷，导致的就是前前后后的实验全白费，结果毫无意义。经济损失不说，浪费的时间和精力，不是钱能衡量的。( d" _" r& H& P$ ~+ }/ U9 d

6 b2 v! x+ B; E建议你严格按照Protocol做，事半功倍。这个实验其实很简单不过，论坛里有很多讨论贴。何必偷这点懒。。。。。

ilovelife

样品之间浓度没必要完全一致,  因为是和自己的内参作比较.  但是PCR扩增效率要保证接近100%, 否则影响结果分析.

ilovelife

样品间的浓度没有必要一致, 因为各自有自己的内参. 但是要保证PCR 效率接近100%, 否则会影响分析结果. 我一般是每次平行做3个反应, 如果条件合适的话, 一般这三个反应之间的Ct值波动会小于0.5.