细胞中蛋白质提取

冰枫de梦

我用的TRIzol法提取细胞中的RNA,加氯仿离心后分层，RNA主要溶解在水相中，那么蛋白质是不是溶解在有机相中，怎么提取有机相中的蛋白质？求高手指点

mansnoopy

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" l; t$ B2 g$ J6 l: {
如果希望分离DNA 和蛋白，有机层同样要予以保留。在除去水样层后，样品中的DNA 和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。共纯化DNA 对于样品间标准化RNA 的产量十分有用

aptx48

其实是非常简单的，invitrogen的trizol的manual里就有所有提RNA/DNA/protein的详细步骤，但是除了DNA提取还算方便，感觉回收trizol里的蛋白是比较麻烦的，花的时间较长，而且提出的蛋白是基本是变性的。
9 L0 H% Q% \" ^7 m细胞内蛋白的提取方法非常多，依后续实验的不同而不同，最好先告诉大家你要做什么实验。

redmaple

tris-hcl 50mM, EDTA 1mM, 1% NP40, 10% 甘油， 加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂。sigma cocktails。

redmaple

提细胞蛋白这样的protocol，到处都有，可以到网上下载。

trl137

1 理论上说，利用trizo可以分别提取DNA，RNA和蛋白质，因为加了三氯甲烷后，就产生分层，这三种物质分别存在，可吸出用不同的溶剂沉淀；9 {  W6 n; G/ _3 S9 l4 ^
2 但是，事实上，这样难度很大，RNA在最上层无色水相，下面的不一定是DNA和蛋白质，因为细胞裂解后，还会有胞外的一些物质，还有多糖类，所以不实际，会有杂质5 |. O, g$ L" q  `' S
3 提取细胞蛋白质有专门的细胞蛋白提取试剂盒

bioaizhiying

Amnion（life teconologies）公司 的trizol是可以同时提取蛋白质，RNA，DNA的，楼主可以下载说明书看看，上面有详细的步骤，而且需用到什么试剂说明书上都写着呢。

sj03572001

加入了氯仿分层后，蛋白质存在于底层的黄色有机相中，可以通过异丙醇进行沉淀，具体方法：将有机相吸出，加入200ul 无水乙醇混匀，室温静置5min， 4度，5500rpm ，离心10分钟，取上清至新离心管中，加入1ml 异丙醇, 充分混匀，室温静置10mim， 4度，13000rpm ，离心10分钟，弃上清，用1ml 含有0.3M盐酸胍的95%乙醇进行洗涤蛋白沉淀，室温静置20min，4度，13000rpm ，离心10分钟，弃上清，洗3次，最后再用无水乙醇洗一次，蛋白沉淀可用1%SDS进行溶解。

mayansen1314

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# A- b9 H$ k6 z; f8 E0 l. N1 y, }- {& `- G4 t9 Y6 A) o: l! D$ `( |
我们实验室一直用的是凯基全蛋白提取试剂盒，按照他上边的说明书操作。# I; [# {) L; D# X( A& l9 d% l* \. ^
不过最经我的蛋白样提的不是很好，还不确定是什么原因
# U6 k' A# u$ F7 |我想应该是我淹没环境温度没控制好

LQAI2012

回复 冰枫de梦 的帖子1 x- u0 a$ j3 k- b0 B) E

( s. P1 H/ u0 ]4 F: D& j沉淀完DNA的中层和下层液体，里面存在着需要的蛋白。
8 x$ k$ M( D( L* a! d沉淀DNA后的上清，用异丙醇好像是可以沉淀下其中的蛋白的。但具体的用量和比例我也不太清楚，不过其它地方应该是可以查到的。
" S0 K1 x; ~( p4 O- v其实，这种方法理论上是可行的。但大家认为它还存在着很多缺点，如，好像有人说这样得到的蛋白不太容易溶解