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本帖最后由 ielisa 于 2012-12-18 16:47 编辑
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小弟要构建两个microRNA的慢病毒载体,同学帮忙一起设计好了引物(使用软件设计),扩增的目的条带为microRNA成熟前体的基因上下游各延伸100bp左右,一共大概三四百bp的大小,然后模板用的是人皮肤细胞抽提基因组DNA(苯酚氯仿抽提法,跑胶可见条带),可是做了几次一直没有P出来,开始时怀疑是退火温度设置不合适,于是梯度PCR也做过了,退火温度从五十多度一直到七十度,也是一个都没有P出来,这是什么情况呢?究竟是哪里的问题呢?哪位大侠做过的帮小弟指点迷津啊!不胜感激,这两天一直在想,都要失眠了~~~
' I' v: B) K' H模板问题?
1 x6 H+ {: ^1 E引物问题?
, z# w4 `8 q! a% U o" O, I" M& F还是PCR温度设置问题?
5 P; x8 ~+ O! m% N8 e1 b$ I求解啊~~~ |
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