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本帖最后由 ielisa 于 2012-12-18 16:47 编辑
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小弟要构建两个microRNA的慢病毒载体,同学帮忙一起设计好了引物(使用软件设计),扩增的目的条带为microRNA成熟前体的基因上下游各延伸100bp左右,一共大概三四百bp的大小,然后模板用的是人皮肤细胞抽提基因组DNA(苯酚氯仿抽提法,跑胶可见条带),可是做了几次一直没有P出来,开始时怀疑是退火温度设置不合适,于是梯度PCR也做过了,退火温度从五十多度一直到七十度,也是一个都没有P出来,这是什么情况呢?究竟是哪里的问题呢?哪位大侠做过的帮小弟指点迷津啊!不胜感激,这两天一直在想,都要失眠了~~~4 J* S5 p% f) ?2 k
模板问题?
3 X( v( T1 b) T6 f z) v4 k r0 k) L引物问题?4 u/ {# _! _" ~: u" ^2 d0 d
还是PCR温度设置问题?' r% W9 }4 j' b* F$ x$ ^% C
求解啊~~~ |
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