石蜡切片之免疫荧光

yeshch

& g  R2 i$ r& F! g, c- o) D4 X& `8 j- \4 I. S) L
请问那个前辈可以给小弟讲解一下免疫荧光的详细原理呀？尤其是加一抗、二抗的注意事项及操作细节技巧~兄弟多谢了！

moluxingke

这些其实有着和做western差不多的原理，首先都是利用一抗识别抗原，也就是你要检测的靶蛋白，然后用二抗结合一抗，起到一个信号放大的效果，因为二抗上带有荧光标记基团，在特定波长的激发光照射下，就发出特定波长的荧光。其中的注意事项，说多也很多，说不多也不多，主要就是保证组织不要放置太久，以免蛋白降解过度，另外抗体好用最重要，特别说明一下，如果做双标，那么一抗就用不同来源的，比如一个是兔抗，那么另外一个抗体就不要用兔抗了，以免二抗不能特异识别，并且二抗的荧光标记也不能一样。知道大致原理之后先试做一遍，就有个大致的概念了，反正很多细节问题都是在实践中发现的。祝你顺利

yeshch

回复 moluxingke 的帖子9 r- e/ c2 t- @+ s( V( j* h
: h' f! u* s- b$ u* f0 w5 s( Z0 p
OK，thanks！

jieniao1

我给你我做的一个protocol吧，一抗是不同源，还有前期根据抗体的要求做不同的处理就行了。
4 ~' C  V) R. T) RDouble immunofluorescence for CNPase and GFAP on fixed paraffin-embedded tissue sections.+ t, j# t% y" P! b! [) i* H8 z
1.        Deparaffinization (2×3 min, Roticlear; 1×3 min, isopropanol; 1×3 min, 96% ethanol).
0 I: g( L9 d, J# f- w2.        Incubate tissues in 0.5% H2O2 solution, 30 min, RT (inactivation of endogenous peroxidase).7 u* a# I# Y. I; t( ^
3.        Rinse tissue with PBS, 1×5 min.0 B2 Z( t+ O5 s9 h1 @% [9 Y" P
4.        Boil tissue in citrate buffer in microwave pretreatment, 20 min (antigen demasking).+ T" O7 G6 T2 k" A
5.        Rinse tissue with PBS, 3×3 min.
+ w+ e2 H  a" c, f9 h1 J$ J6.        Incubate tissue in 20% goat serum, 30 min, (blocking of unspecific antigens).7 R& S; n  V; \5 R  }3 v& Z: y
7.        Incubate tissue with both primary antibodies (CNPase, mouse, 1 : 100; GFAP, rabbit, 1 : 1000), 1 h.
  N: Q% z! |2 t8.        Rinse tissue with PBS, 3×3 min.2 z, t" \  R1 x% `7 q& C/ Z
9.        Incubate tissue with both secondary antibodies (goat anti-rabbit Cy2, 1 : 200, goat anti-mouse Cy3, 1 : 200), 1 h, RT.
. I: b6 ?* A- F5 |10.        Rinse tissue with PBS, 3×3 min.2 d2 W% f* h- M/ `
11.        Incubate cells with bisbenzimide solution, 10 min, RT.6 W) t( c& I: `4 k
12.        Rinse tissue with PBS, 3×3 min.; u2 p* o0 l! W/ e  J$ W; O
13.        Rinse tissue with distilled water, 1×5 min.  a0 V; j8 Z( T4 Y2 v; K
14.        Mount slide with Roti ®-Histokitt II mounting medium.4 E- J7 j6 x& @

yeshch

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2 C1 a4 y7 E1 \  `" D6 k+ Jthanks a lot!i will make an attempt.

yeshch

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3 i" E" b$ B0 L6 Y5 ~0 ?# P
. V! o5 N" a* d7 t& A切片的时候，切出来的蜡条褶皱很严重，而且经常展不开是怎么回事？还有就是材料很容易就跟周围的蜡分离，甚至材料在展片后总是有空洞。还望多指教!

moluxingke

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4 ~6 X9 Q0 L0 g+ V* h8 ^  z" z8 E4 J7 V; _+ i6 n9 r. O4 M: Z& m
蜡片起皱一个原因是刀片钝化。建议及时更换新刀片，另外，有时候全新的刀片也会出现类似现象，这个时候需要将蜡块在冰上预冷一下，然后切片。时不时的用口对着蜡块哈气，这样切出来的片子就没有那么皱，展片时，在载玻片上滴加几滴70%酒精，然后将切好的切片放上去，再转到水槽里面，利用酒精张力，利于展片。展片水温可以适当提高一些。6 i& j' `9 q- M) n; b8 U0 A3 Y) W& B7 a
关于第二个问题，主要是你包埋的时候组织过冷，和周围的蜡没有很好的融合，所以包埋要快，在没有包埋之前，组织最好浸在融化的石蜡里面。 意见仅供参考，也可能还有其他原因，逐个排除吧。

yeshch

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非常感谢你的指导，我再试试看