石蜡切片之免疫荧光

yeshch

: k4 H, U6 x% h; o1 @& u/ y8 L

" E8 K4 I, R3 M2 b7 E/ B5 x请问那个前辈可以给小弟讲解一下免疫荧光的详细原理呀？尤其是加一抗、二抗的注意事项及操作细节技巧~兄弟多谢了！

moluxingke

这些其实有着和做western差不多的原理，首先都是利用一抗识别抗原，也就是你要检测的靶蛋白，然后用二抗结合一抗，起到一个信号放大的效果，因为二抗上带有荧光标记基团，在特定波长的激发光照射下，就发出特定波长的荧光。其中的注意事项，说多也很多，说不多也不多，主要就是保证组织不要放置太久，以免蛋白降解过度，另外抗体好用最重要，特别说明一下，如果做双标，那么一抗就用不同来源的，比如一个是兔抗，那么另外一个抗体就不要用兔抗了，以免二抗不能特异识别，并且二抗的荧光标记也不能一样。知道大致原理之后先试做一遍，就有个大致的概念了，反正很多细节问题都是在实践中发现的。祝你顺利

yeshch

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) v; d  _1 r, E8 y9 ]( F0 U0 v' x) X% a$ N# k
OK，thanks！

jieniao1

我给你我做的一个protocol吧，一抗是不同源，还有前期根据抗体的要求做不同的处理就行了。
) [- |5 U* L6 u2 a2 S6 ~" ]Double immunofluorescence for CNPase and GFAP on fixed paraffin-embedded tissue sections.
8 I, o/ t, r# ]% T7 D! O# b1 H7 _1.        Deparaffinization (2×3 min, Roticlear; 1×3 min, isopropanol; 1×3 min, 96% ethanol).3 U/ E2 s% d6 \1 p" T6 G
2.        Incubate tissues in 0.5% H2O2 solution, 30 min, RT (inactivation of endogenous peroxidase).
. H! n  B, c) [8 R0 |' R8 s# H3.        Rinse tissue with PBS, 1×5 min.$ A* n9 A8 m" R/ I( j2 z) W
4.        Boil tissue in citrate buffer in microwave pretreatment, 20 min (antigen demasking).
; P! Q. _- ]) {) M% s8 W: b5.        Rinse tissue with PBS, 3×3 min." i, }4 V9 a$ u2 x6 O; \2 p: P5 k
6.        Incubate tissue in 20% goat serum, 30 min, (blocking of unspecific antigens).
1 |' r1 \, E- t. a+ j8 W& i7 B7.        Incubate tissue with both primary antibodies (CNPase, mouse, 1 : 100; GFAP, rabbit, 1 : 1000), 1 h.
( o1 g5 w: O# y. j3 a: m1 ^& W8.        Rinse tissue with PBS, 3×3 min.) f  R1 i# `+ V( L  h$ Y
9.        Incubate tissue with both secondary antibodies (goat anti-rabbit Cy2, 1 : 200, goat anti-mouse Cy3, 1 : 200), 1 h, RT.
/ c7 u, l* O) [& {4 q9 m/ t10.        Rinse tissue with PBS, 3×3 min.
) w; `; l' I7 b1 M* e11.        Incubate cells with bisbenzimide solution, 10 min, RT., Q2 @/ M8 A! M
12.        Rinse tissue with PBS, 3×3 min.& g: A! H" I. G# [/ ^/ H
13.        Rinse tissue with distilled water, 1×5 min.' \" p! E9 y$ s
14.        Mount slide with Roti ®-Histokitt II mounting medium.
( B8 P! f2 B6 H8 r$ J3 _

yeshch

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: J+ k7 Q0 J, m& E
  e8 U' H% C# T3 L7 qthanks a lot!i will make an attempt.

yeshch

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1 M% y& ^( J# y# Q
切片的时候，切出来的蜡条褶皱很严重，而且经常展不开是怎么回事？还有就是材料很容易就跟周围的蜡分离，甚至材料在展片后总是有空洞。还望多指教!

moluxingke

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) R4 Q% I: w: `, ]* Z5 _" b
0 r) Z+ f2 h$ {" @1 ~, e) ^% L蜡片起皱一个原因是刀片钝化。建议及时更换新刀片，另外，有时候全新的刀片也会出现类似现象，这个时候需要将蜡块在冰上预冷一下，然后切片。时不时的用口对着蜡块哈气，这样切出来的片子就没有那么皱，展片时，在载玻片上滴加几滴70%酒精，然后将切好的切片放上去，再转到水槽里面，利用酒精张力，利于展片。展片水温可以适当提高一些。
% Z- d' C% x; {关于第二个问题，主要是你包埋的时候组织过冷，和周围的蜡没有很好的融合，所以包埋要快，在没有包埋之前，组织最好浸在融化的石蜡里面。 意见仅供参考，也可能还有其他原因，逐个排除吧。

yeshch

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, L! j% U" t- I
! E4 Z: p9 m9 f# J% Q; V2 g4 C非常感谢你的指导，我再试试看