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本帖最后由 w343989328 于 2015-3-9 11:12 编辑 # K. d. f- o# }) R6 R; I/ h1 Z
) r2 W* M' ]! @' m+ e先说一下我实验的一些情况,我要从组织中分选一类细胞,两个表面抗原,一个正筛一个负筛。用的都是间标的抗体,杂一二抗。9 T+ F1 v1 W K5 w' Q/ b2 j3 b
A抗体来源于大鼠,连着生物素的单抗,用Alexa Fluor 488标记的链霉素作为二抗;
5 ~# E6 Q6 `; x) ^/ b" A' ZB抗体为兔多抗,我用donkey anti-rabbit Alexa Fluor 555作为二抗。- ]2 N8 S2 u5 V0 s0 [$ J
学校的流式分选仪器是BD的AriaII,有358nm, 488nm, 633nm三种激发光,因此我这两个抗体只能选择488来激发。
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! ]4 L6 a) C% e3 X A+ f8 y R% j8 I实验的步骤大概是这样子:组织经胰酶+DNase消化,过滤得到单细胞悬液,镜检、计数。调整细胞浓度到1*10^7cells/ml,加入抗体。冰上同时孵育两个一抗一小时,洗两次,敷二抗半小时,洗两次,上流式前5min加入Hoechst33342,以便在区分掉死细胞。
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以下是几次重复的结果:, W( V2 {/ }8 P5 x7 g' g
! O3 P' p @) ~/ v首先是control组,不知道上头那坨东西是什么细胞(肯定不是死细胞,而且我抗体也不会加错),几次重复都或多或少有这么一群东西;
$ s/ W# h( ?2 m7 A其次,FITC通道勉强能有一群细胞出来,但是整个population,包括nagetive cells,都往右偏;+ P, a( y# z5 }0 }0 Z
而PE通道则整个群往上走,导致我没法分出细胞群。
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! i7 e9 `% M5 U9 `7 D7 `这次结果好很多了,单独PE通道能分出群,但是一旦加入A抗体,则整个群依然往右shift。我这里要强调的是,基本上这个领域内所有的文献都报道这两个抗原属于两种细胞,而且我自己IF的结果也显示两种荧光并不merge,所以这里理论上不存在说细胞同时表达两种抗原的可能。$ }2 r# W4 X- j; t3 D
但是呢,加入A抗体后,基本所有的细胞都会往右shift,所以将PE阳性的细胞带出我用control框出来的门P4。我个人觉得这里应该不能用补偿把细胞往左调吧?
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我重复了一次,和第二次的结果一样,细胞都是往右偏。
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一开始怀疑A抗体浓度过高或者孵育时间太久,但是减少浓度或者时间并没能改善结果。3 P8 B1 k. I, S3 N: \+ a6 N; X
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不知道有没有大神能帮忙解惑,不胜感激! |
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