【跪求流式大神】分选的流式图总是shift

w343989328

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* ~1 x& U" N$ D$ B  B  r先说一下我实验的一些情况，我要从组织中分选一类细胞，两个表面抗原，一个正筛一个负筛。用的都是间标的抗体，杂一二抗。
% a1 r1 t4 _" k; G3 s0 Z0 S( F8 MA抗体来源于大鼠，连着生物素的单抗，用Alexa Fluor 488标记的链霉素作为二抗；2 R1 ~1 ^7 x" J( Y
B抗体为兔多抗，我用donkey anti-rabbit Alexa Fluor 555作为二抗。  S  ~* _* S# O% f
学校的流式分选仪器是BD的AriaII，有358nm, 488nm, 633nm三种激发光，因此我这两个抗体只能选择488来激发。
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' o) ~4 _* Y' y- Y; V1 C实验的步骤大概是这样子：组织经胰酶+DNase消化，过滤得到单细胞悬液，镜检、计数。调整细胞浓度到1*10^7cells/ml，加入抗体。冰上同时孵育两个一抗一小时，洗两次，敷二抗半小时，洗两次，上流式前5min加入Hoechst33342，以便在区分掉死细胞。
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以下是几次重复的结果：  }9 v9 x5 F) @

2015-3-9 10:57 上传

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$ C' C/ D. k2 B; J& ?. [. `首先是control组，不知道上头那坨东西是什么细胞（肯定不是死细胞，而且我抗体也不会加错），几次重复都或多或少有这么一群东西；! h' q9 T; A2 k6 k
其次，FITC通道勉强能有一群细胞出来，但是整个population，包括nagetive cells，都往右偏；# ~( a  J( l# ]5 {: C5 [$ m2 g6 i
而PE通道则整个群往上走，导致我没法分出细胞群。3 t& A( i: K. ]; O4 o4 _

2015-3-9 10:57 上传

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1 {$ B. Q  H7 e# V: I) b6 w2 n: E
这次结果好很多了，单独PE通道能分出群，但是一旦加入A抗体，则整个群依然往右shift。我这里要强调的是，基本上这个领域内所有的文献都报道这两个抗原属于两种细胞，而且我自己IF的结果也显示两种荧光并不merge，所以这里理论上不存在说细胞同时表达两种抗原的可能。
8 ]9 r+ {7 M% R$ U& r但是呢，加入A抗体后，基本所有的细胞都会往右shift，所以将PE阳性的细胞带出我用control框出来的门P4。我个人觉得这里应该不能用补偿把细胞往左调吧？
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2015-3-9 10:57 上传

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1 h/ G  V& @0 _! _
我重复了一次，和第二次的结果一样，细胞都是往右偏。
! w$ z. j' `/ ^0 m; j0 c0 K2 T3 D' e, A, ~  p+ z$ j
一开始怀疑A抗体浓度过高或者孵育时间太久，但是减少浓度或者时间并没能改善结果。/ E9 |! t5 u& i. Z/ t9 p: ]2 C8 k9 D

$ B$ a+ N- x" n: ]2 }9 }: b不知道有没有大神能帮忙解惑，不胜感激！

mantianfeiyun

1. 重做荧光补偿
/ O' ~: z. e0 A$ ?
$ a1 J) q/ z4 [9 k$ s$ Z2. 洗涤流式细胞仪液路系统( Y; l' s4 b+ J# U: R8 h

0 A! D  r& Y5 s个人建议，不一定对。

w343989328

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* @6 N' H& q. M1 Q& M+ c4 C5 r% m6 w+ h: L1 |- B6 R. i
上面的图都是没有设置补偿的。
8 a; F1 P; ^( d- U有一点我不是很明白，我这样只是单个通道的shift，这样调补偿没有意义吧？

dollar007

单标，不需要补偿。7 L1 V5 T1 l  T# v% N
FLOWcheck、FLOWset都做过，没问题吧？+ }9 z5 t" O. `" |' T  `) O
你检查下你的数据采集时间，是否跟你的上样浓度符合——比如上样量为80-100万个细胞，体积300-500ul，那么数据采集速度大致在500-700个/秒，搜集1万个数据也就10来秒的时间。如果采集时间为30-40秒，那就是有很多数据都被仪器当噪音屏蔽了，说白点就是FS阈值设定高了，你当前分析的都是些肥胖细胞，所以图形shift。贝克曼的仪器一般默认是100，BD的不知道，你将它设定低点，再检测。

w343989328

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! _# f: a. z' w, l1 H" g0 n) \" ~
9 [9 m8 X0 l3 w3 o& z5 N谢谢您。您说的FS阈值是指什么呢？( m- b8 l% e& y- n" h
我用FSC SSC框下来的细胞是同一群，我不是很明白您说的肥胖细胞是指。。。

w343989328

顶一个

w343989328

求大神。。

dollar007

流式通常用FS设阈值，贝克曼的通常这个值是100，即FS=100.仪器默认FS值小于100的信号为噪音信号，不纳入分析。初设定参数时，如果不清楚此细胞的特性，我们通常把阈值由低调到高，调到什么值合适呢——调到FS/SS散点图左下角能略看到一些碎片即可。如果阈值设定过高，那么碎片群你图上看不见，同样的有部分细胞信号也被屏蔽了。我以前做CIK双阳检测的时候发现的这个问题，上样量与检测速度不匹配，后来发现是这个问题，阈值采用机器默认的FS=100，在当时的电压下，80-90%的细胞都被漏检了（被仪器屏蔽了，认为是噪音。）当我把FS调整为50的时候，这部分数据才得以在图上显现出来。“肥胖”细胞是我做MSC时爱用的口语，通常MSC“干性”好时，细胞很幼稚、细小，表现为FS和SS值都很小，而一旦MSC成熟或者衰老时，细胞会变得很扁平、肥大，此时FS和SS值都很高。通常而言，肥大细胞即尺寸大，内容物更复杂、丰富，表现为FS/SS值更高，更易被检测出。
+ h/ Y% Q) ]3 p  k, p. `/ q希望对你的实验有帮助。

zz091115

和机器 补偿什么的没有关系 是细胞本身的原因 你做的应该是上皮类细胞 如果是血液系统一般就不会

w343989328

回复 dollar007 的帖子$ k2 K7 K- v3 o- S

. M7 u) `- \) _8 e谢谢你！可是我觉得这里的shift跟SSC FSC两个参数没太大关系啊。