![Rank: 4](static/image/common/star_level3.gif)
- 积分
- 1013
- 威望
- 1013
- 包包
- 2639
|
本帖最后由 w343989328 于 2015-3-9 11:12 编辑 5 Y( y* Y3 E" ?+ p
8 K1 ~) Q% H. b
先说一下我实验的一些情况,我要从组织中分选一类细胞,两个表面抗原,一个正筛一个负筛。用的都是间标的抗体,杂一二抗。
- M0 x l4 i5 w% o4 m* {2 c& c/ G6 BA抗体来源于大鼠,连着生物素的单抗,用Alexa Fluor 488标记的链霉素作为二抗;
+ ]9 B4 K9 R/ e# D) ]' J' [B抗体为兔多抗,我用donkey anti-rabbit Alexa Fluor 555作为二抗。" z- ~2 r/ f: e3 f9 v
学校的流式分选仪器是BD的AriaII,有358nm, 488nm, 633nm三种激发光,因此我这两个抗体只能选择488来激发。8 U# I& H1 V, ]
$ a' \# G4 O0 l- w" _实验的步骤大概是这样子:组织经胰酶+DNase消化,过滤得到单细胞悬液,镜检、计数。调整细胞浓度到1*10^7cells/ml,加入抗体。冰上同时孵育两个一抗一小时,洗两次,敷二抗半小时,洗两次,上流式前5min加入Hoechst33342,以便在区分掉死细胞。9 x/ |7 P) @6 s9 K( B6 c3 J
; h* `# d# w3 g/ Y2 }, C9 u% e以下是几次重复的结果:# b2 E" ?1 f# i
" e8 W# n, d1 b! h6 [
首先是control组,不知道上头那坨东西是什么细胞(肯定不是死细胞,而且我抗体也不会加错),几次重复都或多或少有这么一群东西;% g f4 A6 W% B# d
其次,FITC通道勉强能有一群细胞出来,但是整个population,包括nagetive cells,都往右偏;& g" ^9 [. |' I' E) z
而PE通道则整个群往上走,导致我没法分出细胞群。% X; ~- o* z" S% F5 p z0 h
$ a) {0 l3 ]- d; V2 Y0 u这次结果好很多了,单独PE通道能分出群,但是一旦加入A抗体,则整个群依然往右shift。我这里要强调的是,基本上这个领域内所有的文献都报道这两个抗原属于两种细胞,而且我自己IF的结果也显示两种荧光并不merge,所以这里理论上不存在说细胞同时表达两种抗原的可能。+ _! m7 T( ?- [1 N" c
但是呢,加入A抗体后,基本所有的细胞都会往右shift,所以将PE阳性的细胞带出我用control框出来的门P4。我个人觉得这里应该不能用补偿把细胞往左调吧?
- I& H8 i% k* w$ N3 u
) j9 ^1 R; o( T- L% m: Q我重复了一次,和第二次的结果一样,细胞都是往右偏。# L- c, a8 g& a' D
1 N5 G# L/ V# u一开始怀疑A抗体浓度过高或者孵育时间太久,但是减少浓度或者时间并没能改善结果。+ s6 H) ~# s+ z9 s0 |% \! z/ a4 G; A
8 Q# ^7 T6 t* O% j/ ]$ n
不知道有没有大神能帮忙解惑,不胜感激! |
-
总评分: 威望 + 10
包包 + 20
查看全部评分
|