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本帖最后由 细胞海洋 于 2015-12-22 12:26 编辑 8 Y* D- N) D- @
, g$ Z3 ~+ v4 O* H% b3 c# o有一个相关的，希望对你有帮助
) i$ J* K7 _: H一、目的7 d% t. [7 D0 U8 v- Z+ b
' u9 f" q8 [$ i! S( y
MDCK细胞培养是分离流感病毒及相关研究实验的基本技术。疾控中心的所有技术人员，必须按照本文件相关的操作规程进行操作。4 T: j: H w: E' H- F; }* D
! S% e5 W$ V- }1 O; j
二、适用范围
' \: K! D, c3 r3 @$ Y$ q/ E& y" e3 Z, B' C8 S" o' E
适用于疾控中心所有技术人员 。% W6 N- r+ m. |
Y2 f! o9 d! Y
三、程序/ N3 g$ V/ g5 a2 U4 e8 M
6 C) |* g2 p' H8 p（一）生物安全要求$ P: o+ v# I5 J; W9 C$ M
) X6 W0 J f/ z5 _5 B/ V" o5 v
实验室生物安全级别：BSL-1$ {" T C7 F$ Y% K
0 V# z2 I% f5 n( m7 k所有操作必须在BSL-1实验室的生物安全柜里进行。$ K+ Q8 d7 J, {
- J0 |, L; Z+ G: |
（二）材料
( H5 J5 T" y) [0 r6 ^3 C+ I, |. `, l
0 \& }$ t/ g, E% ?2 ` {1. 生长成片的MDCK细胞' h: z, @$ @' }7 P
% S% t$ S* o* E) @7 E
2. 无菌的T25细胞培养瓶) M! @0 L: G$ b6 }- Y
6 ^& O; a1 C* j
3. D-MEM培养液（含有L-谷氨酰胺）7 c- P( r# v* o8 X/ i
: Z: R- d4 Q( ]: y$ m$ z$ x# d
4. 青、链霉素母液（10000 U/mL青霉素G；10000µg/mL硫酸链霉素），分装后保存于-20℃
. T7 {9 l8 E. X0 ~
: g. s# B0 C8 ~* j4 i5. HEPES缓冲液，1M母液
( w C7 q- k, Q
: b$ g8 h2 x" h6. 胎牛血清
q. ^. Z- W3 n6 W# J/ ^' ?* Q
, o: H5 p# \( p0 {7. EDTA-胰酶（0.05%胰酶，0.53mM EDTA-4Na），分装后保存于-20℃
$ ^7 | `0 I. E! @ F9 Q) g% j# ?6 t( K! T# ^6 n
8. 7.5%牛血清白蛋白组分V( D5 ~6 M1 e0 n. ?7 M3 E
$ v) Z7 F5 a# X: J P/ Y, W6 o9. 1mL、10mL无菌移液管
; N7 ?( b& y+ m$ e
) h& Y* P( \, [$ [/ `( T10. 70％～75％的酒精) n( d1 s, D" e" j
9 Z/ [' e/ z L) w6 H: M5 z2 ~
注意事项：经常检查试剂使用的有效期。8 c# _- ]/ m; y6 U5 T) e
5 B Z3 k9 V, }- ?! E4 j$ Z8 I6 P) S: x3 z# u
（三）实验步骤( M6 d9 B1 o' e: k. j0 X3 v9 T
3 N4 Z$ s) i) }" _- l- D这里以T75细胞瓶的单层细胞培养为例，叙述MDCK细胞的培养程序。如果细胞瓶的规格有变，MDCK细胞悬液的量必须做相应的调整。
$ `3 N6 t0 }9 Y+ k% W" q
8 }- r; v" c& m- Q1 u1. D-MEM培养液的准备& |( O+ h e) D
2 {% r8 f4 Y2 Q" @& J( n500mL D-MEM液中加入：+ {9 {$ J2 q) ^& S o4 l( q' c
/ s& b' Q3 H+ _% H' M6 K青、链霉素母液5mL（终浓度达：100U/mL青霉素；100µg/mL链霉素），5 d1 E) ~, I" S; R; S4 U+ t0 x
# O: P. U1 C0 g# D6 qHEPES缓冲液12.5mL（终浓度：25mM）。
$ S; ]& i/ c2 x5 s
* P) Y8 I! T3 @$ _7.5%牛血清白蛋白组分Ⅴ 12.5mL
) O/ V) ^% ?$ }6 l" r9 [
+ l; @+ v }4 N$ l7 h2. 细胞生长液的准备
; h- f/ v- Y% p3 |. {2 U- f7 v( s" d
( f+ o% Q7 @& }. C& L# b胎牛血清10mL加到90mL的上述（1）的液体中，使胎牛血清的终浓度为10%。5 y% f/ s. Z: F |0 K
' A/ }+ T* R6 n3 Z; ?. \- s& u6 ?3. 首先将细胞培养瓶中的培养液弃去，加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶。
& q% X* |7 P) d% o& p% x; U: V$ u
; G8 _" Y0 Q/ o5 t4. 温和地摇动细胞瓶1min，使EDTA-胰酶均匀分布在整个细胞薄层。然后用移液管吸去EDTA胰酶。/ {5 h0 E; q1 H4 l5 |
& P+ E# P# Z( y+ q* w7 ]
5. 重新加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶重复上述步骤。- w2 E( {& U! f( V
7 u" {+ u+ `, l0 N$ \
6. 加入1mLEDTA-胰酶使其均匀分布在整个细胞薄层，37℃孵育细胞瓶直至细胞从塑料细胞瓶的表面分离（约5～10min）。必要时可以摇动或吹打来分离细胞。然后加入1mL胎牛血清灭活残余的胰酶。
4 p4 x* T& ^7 V' S+ Y; }4 F: r7 U1 H1 f t
7. 加9mL已经配置好的含有L-谷氨酸的D-MEM培养液，轻轻用移动移液管来吹散细胞团。
9 ^6 ^, @+ W. ]3 K) S) s" O8 P$ V3 n* O" e/ u
8. 取10mL混合物加到90mL细胞生长液（细胞悬液的浓度大约为每毫升含105细胞）4 n& n J. @$ E6 J: e: I; e
0 b" }8 S# g; d1 z, }9. 每个T25细胞培养瓶加入6mL（6×105/mL）细胞悬液，剩余的细胞悬液可以加到T75细胞瓶用于细胞传代。通常6mL细胞悬液2～3日可生长成片（80％～90％）的单层细胞。
3 d4 K4 P9 j/ Z. U8 k7 ^" p3 p+ M3 W- N+ V
10. 于37℃，5%CO2培养箱里培养细胞，每天观察细胞状态，以供进一步实验用。
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发表于 2015-12-17 08:53
