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不同的细胞已及转不同面积的孔板操作起来略有不同,以转染六孔板的贴壁细胞为例:/ j d& |/ }# i# I% z+ X+ n, x1 p: @; [
1.接种细胞。转染前一天将细胞接种至六孔板内。细胞接种数量视其生长速度而定,一般为1×106个细胞。转染时要求细胞汇合度为90~95%。转染前两小时对细胞进行换液。
' m; V" G& {2 n2 m+ \- t2.将4ug的质粒DNA加至250ul的OPTI-MEM培基中,混匀。
. Z( b! f, w) Y, G3.将10ul的Lipo2000加至另外250ul 的OPTI-MEM中,轻轻混匀,室温静置5分钟。
2 R* }) Y/ i8 \7 M5 y4.将DNA悬液和Lipo2000悬液混合,总体积500ul,轻轻混匀,室温静置20分钟。
0 y7 k: I1 [% _5.将DNA和Lipo2000混合液加至六孔板的孔内,前后左右晃动孔板混匀,置于培养箱中培养。" i1 G3 s1 }) t+ i5 w
6.转染4-6小时后,细胞换液,每孔2ml培基。
/ H2 D4 H+ H0 [7 c7.转染18-48细胞后,收集细胞检测表达,或加入抗性培基筛选稳定表达克隆。1 q$ G# R- a. y) V: M- l: Z
" i/ W6 Q/ a0 y
注:1. 如果没有OPTI-MEM培基,用培养细胞的无血清基础培基替代也可以。
. T2 P5 w$ Y+ `' v 2. 该说明为一个孔的用量,同时转几个孔时按需加倍。若转染其他类型孔板,DNA和Lipo2000用量参见试剂盒说明书中的表格。可根据实际质粒和细胞的转染效率,分不同量摸索最佳DNA和Lipo2000的混合比例。3 N6 a* e! h) g& Q5 w* d
3.转染4-6小时后也可以不换液,但由于Lipo2000具有一定的细胞毒性,作用时间过长可能使某些细胞出现大量死亡现象,建议换液。& ~: X* f Q4 j0 X1 k# E [: T
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