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不同的细胞已及转不同面积的孔板操作起来略有不同,以转染六孔板的贴壁细胞为例:+ v- U8 g9 S8 b; S
1.接种细胞。转染前一天将细胞接种至六孔板内。细胞接种数量视其生长速度而定,一般为1×106个细胞。转染时要求细胞汇合度为90~95%。转染前两小时对细胞进行换液。
2 X- ~1 j6 O, l2 r- s! P% \2.将4ug的质粒DNA加至250ul的OPTI-MEM培基中,混匀。) v; |& W$ n5 v# c6 j: ~, C7 p
3.将10ul的Lipo2000加至另外250ul 的OPTI-MEM中,轻轻混匀,室温静置5分钟。
& Z1 l. l4 Q$ H) V5 x4.将DNA悬液和Lipo2000悬液混合,总体积500ul,轻轻混匀,室温静置20分钟。5 D8 D/ K5 `" o! P/ N6 g& x
5.将DNA和Lipo2000混合液加至六孔板的孔内,前后左右晃动孔板混匀,置于培养箱中培养。& R# S7 Z! o* o4 i1 j" }& p8 E
6.转染4-6小时后,细胞换液,每孔2ml培基。
; V$ M2 v8 J# _4 j7 O Y* X) V7.转染18-48细胞后,收集细胞检测表达,或加入抗性培基筛选稳定表达克隆。4 t3 f$ Q7 a5 N5 S4 `+ T
+ t3 j k; y+ g0 o+ A% T
注:1. 如果没有OPTI-MEM培基,用培养细胞的无血清基础培基替代也可以。$ C! I4 S( R3 H& T
2. 该说明为一个孔的用量,同时转几个孔时按需加倍。若转染其他类型孔板,DNA和Lipo2000用量参见试剂盒说明书中的表格。可根据实际质粒和细胞的转染效率,分不同量摸索最佳DNA和Lipo2000的混合比例。 {' b }4 Y! R6 M* I
3.转染4-6小时后也可以不换液,但由于Lipo2000具有一定的细胞毒性,作用时间过长可能使某些细胞出现大量死亡现象,建议换液。 l0 P' \0 x5 \ T8 N, F
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