石蜡切片之免疫荧光

yeshch

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: I) \3 J! h, i/ f* _: y
请问那个前辈可以给小弟讲解一下免疫荧光的详细原理呀？尤其是加一抗、二抗的注意事项及操作细节技巧~兄弟多谢了！

yeshch

回复 moluxingke 的帖子3 Z' }% C  V5 a" y2 |. x: \

7 g2 |. Y; I/ @4 q) e4 \5 S6 z非常感谢你的指导，我再试试看

moluxingke

回复 yeshch 的帖子
5 o  g: w5 {! W% h! i+ W( R  Z' J9 o' _0 j7 {, F* r
蜡片起皱一个原因是刀片钝化。建议及时更换新刀片，另外，有时候全新的刀片也会出现类似现象，这个时候需要将蜡块在冰上预冷一下，然后切片。时不时的用口对着蜡块哈气，这样切出来的片子就没有那么皱，展片时，在载玻片上滴加几滴70%酒精，然后将切好的切片放上去，再转到水槽里面，利用酒精张力，利于展片。展片水温可以适当提高一些。
8 H, j1 k0 N+ h* h4 p关于第二个问题，主要是你包埋的时候组织过冷，和周围的蜡没有很好的融合，所以包埋要快，在没有包埋之前，组织最好浸在融化的石蜡里面。 意见仅供参考，也可能还有其他原因，逐个排除吧。

yeshch

回复 moluxingke 的帖子6 G3 }: [4 F& z; N0 J. D* R
9 A$ [, U/ V% E! e: K/ I7 m0 S
切片的时候，切出来的蜡条褶皱很严重，而且经常展不开是怎么回事？还有就是材料很容易就跟周围的蜡分离，甚至材料在展片后总是有空洞。还望多指教!

yeshch

回复 jieniao1 的帖子7 p0 G/ [# R) F3 w

( J4 A) g$ \) }1 j9 j/ athanks a lot!i will make an attempt.

jieniao1

我给你我做的一个protocol吧，一抗是不同源，还有前期根据抗体的要求做不同的处理就行了。
! h* _5 i1 |4 O% T" l: v- `Double immunofluorescence for CNPase and GFAP on fixed paraffin-embedded tissue sections.
: ]! @7 ?. @: u; a0 o6 a+ l1.        Deparaffinization (2×3 min, Roticlear; 1×3 min, isopropanol; 1×3 min, 96% ethanol).% `' z% a* G& K' d
2.        Incubate tissues in 0.5% H2O2 solution, 30 min, RT (inactivation of endogenous peroxidase).. W) Z5 \( A. Z
3.        Rinse tissue with PBS, 1×5 min.
$ p  J2 e* N! V7 [4 P7 c4.        Boil tissue in citrate buffer in microwave pretreatment, 20 min (antigen demasking).
$ x7 D* A; K* k9 S* ?3 ~2 R4 M: A5.        Rinse tissue with PBS, 3×3 min.
7 j$ w9 [7 n. T! q) U0 t6.        Incubate tissue in 20% goat serum, 30 min, (blocking of unspecific antigens).2 A# }: Q5 {5 w3 T3 h; f# w
7.        Incubate tissue with both primary antibodies (CNPase, mouse, 1 : 100; GFAP, rabbit, 1 : 1000), 1 h.
# E( ^' O5 Q( C8.        Rinse tissue with PBS, 3×3 min.( R" n3 L4 {& G0 }# x) d
9.        Incubate tissue with both secondary antibodies (goat anti-rabbit Cy2, 1 : 200, goat anti-mouse Cy3, 1 : 200), 1 h, RT.
4 H7 U) Y& C/ @! f* Q" {8 s10.        Rinse tissue with PBS, 3×3 min.7 g: \3 N1 J# ?* ?& u+ x2 ?$ w
11.        Incubate cells with bisbenzimide solution, 10 min, RT.
9 {  G0 D5 i0 v0 H- e" x12.        Rinse tissue with PBS, 3×3 min.! C* [' N* Q2 I/ @; \
13.        Rinse tissue with distilled water, 1×5 min.
4 v; Y. w' b& i4 m8 `- D9 j14.        Mount slide with Roti ®-Histokitt II mounting medium./ R3 a# @  P4 p) v- v$ ^& N

yeshch

回复 moluxingke 的帖子
$ l3 ^( |( E$ \* Z) u$ {8 y& }' {, g3 F7 [
OK，thanks！

moluxingke

这些其实有着和做western差不多的原理，首先都是利用一抗识别抗原，也就是你要检测的靶蛋白，然后用二抗结合一抗，起到一个信号放大的效果，因为二抗上带有荧光标记基团，在特定波长的激发光照射下，就发出特定波长的荧光。其中的注意事项，说多也很多，说不多也不多，主要就是保证组织不要放置太久，以免蛋白降解过度，另外抗体好用最重要，特别说明一下，如果做双标，那么一抗就用不同来源的，比如一个是兔抗，那么另外一个抗体就不要用兔抗了，以免二抗不能特异识别，并且二抗的荧光标记也不能一样。知道大致原理之后先试做一遍，就有个大致的概念了，反正很多细节问题都是在实践中发现的。祝你顺利