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本帖最后由 w343989328 于 2015-3-9 11:12 编辑
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$ J* @2 s6 _, N( y9 E& L先说一下我实验的一些情况，我要从组织中分选一类细胞，两个表面抗原，一个正筛一个负筛。用的都是间标的抗体，杂一二抗。
) z. g# {, |5 [7 U; JA抗体来源于大鼠，连着生物素的单抗，用Alexa Fluor 488标记的链霉素作为二抗；; M7 u- {% m9 {# ?
B抗体为兔多抗，我用donkey anti-rabbit Alexa Fluor 555作为二抗。
& G% ~, m& a9 f* b学校的流式分选仪器是BD的AriaII，有358nm, 488nm, 633nm三种激发光，因此我这两个抗体只能选择488来激发。
5 ?7 @) Q. Y% N! ]4 h) q: ], ~4 }- V) d7 `. w; G( ]& }+ ]
实验的步骤大概是这样子：组织经胰酶+DNase消化，过滤得到单细胞悬液，镜检、计数。调整细胞浓度到1*10^7cells/ml，加入抗体。冰上同时孵育两个一抗一小时，洗两次，敷二抗半小时，洗两次，上流式前5min加入Hoechst33342，以便在区分掉死细胞。0 M. y/ T* L# W0 z
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以下是几次重复的结果：& l9 I+ t W# l) J" k3 f/ E
; u5 W0 P0 H& C2 k8 w首先是control组，不知道上头那坨东西是什么细胞（肯定不是死细胞，而且我抗体也不会加错），几次重复都或多或少有这么一群东西；5 g1 [; G1 j2 U7 i k4 Z& {
其次，FITC通道勉强能有一群细胞出来，但是整个population，包括nagetive cells，都往右偏；
! u& t+ {/ q9 A& P7 X$ r而PE通道则整个群往上走，导致我没法分出细胞群。 V0 T" n9 f1 _# d2 K( j" N9 b
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这次结果好很多了，单独PE通道能分出群，但是一旦加入A抗体，则整个群依然往右shift。我这里要强调的是，基本上这个领域内所有的文献都报道这两个抗原属于两种细胞，而且我自己IF的结果也显示两种荧光并不merge，所以这里理论上不存在说细胞同时表达两种抗原的可能。
3 n0 h0 |5 S P" F0 T但是呢，加入A抗体后，基本所有的细胞都会往右shift，所以将PE阳性的细胞带出我用control框出来的门P4。我个人觉得这里应该不能用补偿把细胞往左调吧？
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4 L8 L& C+ B1 O2 i我重复了一次，和第二次的结果一样，细胞都是往右偏。# i6 j3 e( f- x! t' g3 i( m5 D" Y
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一开始怀疑A抗体浓度过高或者孵育时间太久，但是减少浓度或者时间并没能改善结果。8 ^( D; ]5 n- K) k* W
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不知道有没有大神能帮忙解惑，不胜感激！ |
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发表于 2015-3-9 11:12
