关于ES细胞培养液的pH问题

carolshen

在文献中，基本上没有提过这个问题，想请问下这里的朋友们，请问你们在培养ES细胞时，考虑了培养液的pH吗？

hyde

请教各种细胞培养基的颜色
8 y. F: Y6 t; T$ \http://www.stemcell8.cn/thread-25937-1-1.html
+ U2 ?0 l- f5 p* {( R

痞子的烟头

以前我们实验室用的都是买的培养基DF12，其它的直接加上就可以用，没有测试PH，但是如果是自己的配，必须要测试！

上海过客

新配出来的 培养基是亮黄色 。 加进去过一段时间 后变红色 。 再变成黄色 就不能用了 。. X  U6 j2 K' P/ p
8 j% e% W# d% r

carolshen

呃，不好意思，谢谢大家的关注！
2 [6 V" H1 c* b9 |忘说明一下，我用的是条件培养基，就是制完conditioned medium之后，你们还有调节pH吗？

heather_lu

一般不调

syl82

( u7 E7 O3 l3 g5 m' x, {% O0 N, H9 d# i  q. a' [) \1 c9 c
常见的干细胞培养是胚胎干细胞（ES cells）培养。我们以小鼠的胚胎干细胞培养为例。
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小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts，MEF）的复苏
1 U2 `* A! ~& [; e+ Y$ m胚胎干细胞一般是在37℃、5%CO2和95%湿度的培养条件下，生长在铺有一层滋养细胞层的细胞培养皿或者是细胞培养瓶中（此处以细胞培养皿为例）。因此要先铺滋养层细胞。 # [* m* x, I& F1 X2 Q
* m* ?8 K# q% g& X) ~  M
在37℃水浴锅里快速融化一管液氮冻存的小鼠胚胎成纤维细胞。 5 g* R5 c$ J) w1 X
把融化的细胞悬浮液加到装有几毫升预热好的MEF培养基的无菌离心管中，轻轻混匀后，1000×g ，5min离心收集细胞。
) ]" T0 _2 K: P/ h- J; C5 R' [0 H吸掉上清（除去冻存液中的DMSO），用10ml预热的MEF培养基重悬细胞后，加到一个10cm的细胞培养皿中，放入37℃，含有5%CO2的加湿培养箱中培养。
4 P  q' l) A) U: }根据情况对细胞进行换液，大约4天左右，细胞就可以基本长满整个培养皿，这时可以进行传代、冻存或用于制备滋养细胞层。
8 X. I9 H: Q: O# y/ @滋养细胞层（feeder cells layer）的制备 # X8 J: Q; z6 k
把长好的小鼠胚胎成纤维细胞的培养基吸掉，加入10ml新鲜的MEF培养基，并在避光的条件下加入110μl配好的丝裂霉素C，混匀后放入培养箱培养2h。 ( X, ]4 p3 q) \( G8 ?9 W
把含有丝裂霉素C的培养基用无菌的15ml离心管收集起来避光保存，在一周之内可再次使用（直接使用该培养基处理细胞5h）。用PBS(不含二价离子)洗涤细胞2到3次后，用1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约3min，直到细胞悬浮起来。
' q0 W4 q. C" Q+ i用1ml MEF培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。
' O, \/ u1 u" I6 x! Q去掉上清，用1ml MEF培养基重悬细胞，之后把细胞平均分到两个经过0.1%明胶处理过的细胞培养皿中，用MEF培养基培养细胞。（明胶处理：加5ml 0.1%的明胶到细胞培养皿中，在37℃培养箱中至少放置10min，之后把明胶吸掉即可）
: }  ?8 p) e# r' F4 J+ b* X5 I一般处理好的小鼠胚胎成纤维细胞在1~2h之后即可以贴壁，形成滋养细胞层，这时的滋养细胞层即可用来培养小鼠胚胎干细胞。制备好的滋养细胞层可以在MEF培养基中保持1周左右的时间，或者是把细胞冻存。
+ T7 r' T6 V  c9 J: \' B9 z8 h( l小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cells，ES cells）的复苏 $ R* |! F0 p, s" w
在37℃水浴锅里快速融化一管液氮冻存的小鼠胚胎干细胞。 - w- K1 s$ A1 a4 C
把融化的细胞悬浮液加到装有几毫升预热好的ES培养基的无菌离心管中，轻轻混匀后，1000×g ，5min离心收集细胞。
- ], j' h( I& {( m! C, s6 V吸掉上清（除去冻存液中的DMSO，用10ml预热的ES培养基重悬细胞后，加到一个10cm的铺有滋养细胞层的细胞培养皿中，放入37℃，含有5%CO2的加湿培养箱中培养。
& B% B6 \) S3 J' E% a根据情况对细胞进行换液，大约3~4天左右，细胞就可以基本长满整个培养皿，这时可以进行传代、冻存或用于后续试验。
; K9 V0 A, f/ L1 @2 Y3 P2 t小鼠胚胎干细胞的传代
1 L- J8 ~  S; w6 X& ?! ^! r& a8 |吸掉培养基，用PBS(不含二价离子)洗2~3次后，加1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约5min，直到细胞基本悬浮起来。 7 w0 r7 @" \' M: D
用1ml ES培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。
# m! L* Q6 W" s) G! m) T去掉上清，用几毫升ES培养基重悬细胞，之后根据培养皿规格和分配比，把细胞按一定比例分到铺有滋养细胞层的细胞培养皿中，加ES培养基培养。ES细胞的分配比可以是1:1到1:10。
* H3 a/ r8 X: O/ d2 O小鼠胚胎干细胞的冻存 / ]& O' m5 B0 r0 p7 g0 s
吸掉培养基，用PBS(不含二价离子)洗2~3次后，加1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约5min，直到细胞基本悬浮起来。
: S6 ?/ j6 _5 O; u+ z2 T# D用1ml ES培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。 * l6 Y: A% p  R# n
去掉上清，用预先配制好的预冷的ES细胞冻存液来重悬细胞（冻存液的量视冻存的细胞量来定，一般一个长满的10cm细胞培养皿可以冻存4~6管），按每管1ml的量分装到冻存管中。梯度降温：4℃20min，-20℃20min，-80℃过夜后迅速转入液氮中。 7 ]- s* ?2 U$ G+ T& k2 M5 I
注意事项
' [( L' D, Z( n* V* H, g1 q( ?丝裂霉素C在操作时要避光，避免其分解。
" f2 D6 {& k  V5 OES细胞倾向于聚集生长，因此在复苏时，要选择好培养皿的规格 ) D  P) Q- a7 I, \' Q, o# v7 W# \
ES细胞不能长的太满，应避免使各个克隆之间接触，以免发上分化。 7 y$ m/ s6 m( G
为避免水或血清带来的污染，对血清应进行支原体检测，配好的培养基要进行污染测试。