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* q/ Z7 l, @% [
q5 n. W& k4 ]荧光原位杂交探针的制备和荧光原位杂交9 W3 O0 ~6 b5 n* R' D ?
# c M0 p9 N( o
实验流程 a! c* c; P! F0 a% t
9 b0 I, ^& f* }- Q" f9 _( y
第一天
3 \( a) G2 C( I; F缺口平移标记探针( H5 L$ I6 h4 J9 G0 E: c" y
1.1 试剂准备# H7 a: z' o" r! Q
(1) 0.1mmol/L dNTP4 P' L2 \ R. J' y9 e( D; s7 ^
0.3mmol/L dATP、0.3mmol/L dCTP和0.3mmol/L dGTP等体积混合。
1 S; i% P& E, @! h) a(2) 0.1mmol/L dTTP
+ x1 h( V* u9 X1 X1倍体积的0.3mmol/L dTTP和2倍体积的三蒸水混合。! d7 q) q" S! ]; I& G( T2 L" S
1.2 缺口平移体系和反应条件) u; M A* \& c" T4 } ~ l
0.1mmol/L dTTP 6.5μl8 F3 u4 e: k5 b
0.1mmol/L dNTP 10μl
i! ?3 ~; K& C' s10× Nick Translation buffer 5μl
. f( J+ N7 e# ~8 ^1mmol/L DIG-11-dUTP /Biotin-16-dUTP 0.5μl
2 ]/ j- V2 \/ v! n5 ]3 sNick Translation Enzyme 10μl, U8 z$ I8 ?7 y5 [* l6 N6 v/ w
DNA (1μg) X μl5 R f9 \% |; O3 r( Z
H2O 18-X μl
, j4 T( d1 Y2 min total 50μl
9 l8 d5 a* T* k以上为标记1μg DNA的缺口平移体系,若标记更多量的DNA,则试剂量和反应体系相应等倍扩大。各成分混匀后短时离心。对于≤10kb的质粒,于15℃ 反应3.5小时;对于BAC/PAC,于15℃ 反应9小时。1 I7 Z3 j2 T: A9 n9 c1 n" ?
1.3 凝胶电泳判断探针大小9 t4 s- t( |4 N! W+ n/ w9 a
将EP管置于冰上,取其中5μl 于70℃加热5分钟后行2 %琼脂糖凝胶电泳以观察所标记探针的大小,单一序列探针合适大小为200~600bp;如片段大小偏大,则于15℃延长反应10~30分钟,再重复进行凝胶电泳,直至得到合适大小的探针。
/ ]$ H& a) }7 m; L$ g1.4 终止反应
. N2 ~! Z2 A7 k! ^' P- n/ V+ t- f向反应体系中加入1μl 0.5M EDTA和(或)70℃加热5分钟,以灭活酶。探针于-20℃保存备用。! l# ~0 w3 I7 D0 _$ V, k/ d% H: W! ^
1 e9 n1 M; P+ \8 [2 C第二天
" W4 W! \. j) M( V' e0 d1 z1. 探针的沉淀和变性1 O" l8 \0 q3 ]) s2 \$ O5 {
1.1 探针混合物的组成: Z/ O! [! f1 @# j) h" \9 B# q r
(1) 对BAC/PAC探针' Q' Z- `- t& g0 _% a# [( ^
DNA探针 5ul1 f3 a% j- e% M4 a+ @4 t
Human Cot-1 DNA 3ul6 @1 t7 \9 I2 T& c5 @7 m
Salmon Sperm DNA 0.5ul
- O- `4 G5 n# A: j: p: ~H2O 1.5ul; h4 [* t v- Q/ J
in total 10ul
7 q. \/ F, a9 w" n8 e1 Z. }& e! ](2) 对着丝粒探针: a" \7 }% `. E& g7 v! W
DNA探针 5ul. z+ s; ^% \+ r4 W+ m
Salmon Sperm DNA 0.5ul& o7 M4 O/ W# c2 W( c
H2O 4.5ul
/ p1 S/ T& v1 R+ S- j3 ain total 10ul
9 m7 r6 w- I5 j1 e, o1.2 DNA的沉淀
' S1 O/ e- A( D将探针混合物与1ul(V/10)3M 醋酸钠(PH5.2)和27.5ul(2.5V)无水乙醇(-20℃冻存)混合,-80℃沉淀30min(或-20℃沉淀过夜),以14000g在4℃离心30min,以沉淀DNA。
2 i! h5 I. w( H. q! \1.3 清洗沉淀
z9 N, J) m: I ]; d小心弃去上清,用70 %乙醇洗涤一次,再次以14000g在4℃离心15min;小心弃去上清,在45~50℃的中温水浴中风干DNA沉淀10~15min。4 w4 C: T( @/ }! c9 M( D+ l- d N
注:当大部分乙醇蒸发时,白色的DNA沉淀变为半透明状;一定要彻底清除乙醇,否则会在加入Master Mix后产生微小的沉淀,导致高背景。
* r- l" V: K, Z! g4 R& M/ c1.4 溶解探针
h& ?3 ~) |: O* Y* B% r加入5μl 预热至37℃的去离子甲酰胺(PH 7.0),短时离心后在37℃振摇30min以充分溶解DNA;再加入预热至37℃的Master Mix 5μl,短时离心后在37℃振摇15~30min。
* _" Z7 a8 x' y) U/ l) Z# _4 l' Y注:振摇时间尽可能延长;DNA沉淀亦可以TE缓冲液1.1μl溶解后加入Vysis探针缓冲液4.4μl稀释,混匀后瞬时离心,37℃振摇15~30min。 o0 w7 T) O- ]4 S6 z
1.5 探针的变性和预杂交1 c1 M0 L- O+ G
短时离心后于80℃水浴中变性探针10min,冰浴5分钟;短时离心,于37℃水浴中预杂交30~60min;独特序列探针(如cDNA)和重复序列探针(如α-卫星DNA)探针,无需预杂交。5 P, P- w& ?- l) U, p" ?
2. 标本(染色体靶DNA)的处理和变性 m5 l, c3 ]$ D k( U: n! Q
2.1 滴片和老化
$ C: _0 v- O/ ]取出储存于-20℃的细胞悬液标本,以1100 rpm.离心10min沉淀细胞,换用适量体积的新鲜甲醇:冰乙醇(v/v)=3:1固定液重悬细胞并调整细胞密度,滴片,划出杂交区域,晾干;在预热到 37℃ 的2×SSC中老化30min(也可实验前夜室温过夜老化再以2×SSC浸泡2分钟);依次于70 %、90 %和100 %的梯度乙醇中依次脱水,每缸2min,晾干(以下略作“梯度乙醇脱水后凉干”)。$ K* C, D0 J1 x+ {' X
2.2 RNase A消化4 p- {) n6 E3 X% p s& R, `5 t
每张玻片上加30μl 100μg/ml RNA酶(将10mg/ml的RNase A储存液稀释100倍),盖上22×22mm盖玻片,置于37℃湿盒中孵育1小时;室温下2×SSC中振荡洗涤,5min/次×3次;梯度乙醇脱水后凉干。5 {& \. z! i: e9 @
2.3 靶DNA的变性, U3 A7 M# \, p3 I @
将玻片放入预温至72℃(每增加一张玻片,温度要提高1℃)的70 %去离子甲酰胺/2×SSC中变性2分钟后,立即置入预冷至-20℃保存的梯度乙醇脱水晾干。/ l9 Q" F3 ]4 N, L6 D
2.4 蛋白酶消化
9 {8 m' {( {+ T5 H) S* N/ z8 m将50μl 100 mg/ml的胃蛋白酶(终浓度为0.01 %)加入预温至37℃的50ml蒸馏水(PH 2.0,以适量稀盐酸酸化)中,混匀;将变性后的玻片放入其中处理10分钟;室温下1×PBS中振荡洗涤,5min/次×2次;室温下梯度乙醇脱水后凉干。
7 @* z" ~$ i; W注:靶DNA的变性和消化应与探针变性同步进行,完成后尽快进行杂交。4 c2 R. D. l" i
3. 杂交
) J6 h. E: t$ k& b2 W将变性后的DNA探针加于玻片杂交区域,盖上22mm×22mm盖玻片,封片后置于湿盒中,37℃杂交过夜。
9 a: L1 _$ g; K
' ?1 J$ G3 L o5 o% v第三天
+ Z* E* Q; o0 o" V. b$ C) y1. 杂交后洗涤和半抗原信号放大7 E. H8 j" ?, ~; B
1.1 杂交后洗片" n" E1 [* L8 m/ e7 C9 h. A
小心揭去封片胶和盖玻片,将玻片置于预热至46℃的50 %甲酰胺/2×SSC中,5min×3缸;将玻片移入室温下4×SSC/0.1 % Tween-20中振荡洗涤5min×2缸;每张玻片滴加30 μl阻断液1,盖上22mm×22mm盖玻片,于37℃湿盒中孵育30min;再次将玻片移入室温下4×SSC/0.1 % Tween-20中振荡洗涤5min×2缸。, n9 n- ^( ~, w+ v/ T L
注:此后步骤应注意避光操作。
* y3 @/ I. u1 }) z1 O- M' K- \1.2 滴加一抗
) \& X% R0 V$ ]将4 μl Anti-DIG monoclonal antibody 和0.5 μl Texas-red-Avidin 稀释于100 μl 抗体稀释液1中,混匀;每张玻片滴加25 μl 于杂交区域,盖上22mm×22mm盖玻片,于37℃湿盒中孵育1小时;室温下4×SSC/0.1 % Tween-20中振荡洗涤5min×2缸。# t2 a2 R/ |5 p
1.3 滴加二抗! O' O6 B2 G* P+ g3 M
将4 μl Anti-mouse-Ig-DIG 和1 μl Biotinylated goat anti-Avidin 稀释于100 μl 抗体稀释液1中,混匀;每张玻片滴加25 μl 于杂交区域,盖上22mm×22mm盖玻片,于37℃湿盒中孵育40min;室温下4×SSC/0.1 % Tween-20中振荡洗涤5min×2缸。
* _( f- N% O. @/ U' a: C5 u1.4 滴加三抗- ~# ~2 {4 | p: E' ]
将4 μl Anti-DIG-Fluorescein和0.5 μl Texas-red-Avidin 稀释于100 μl 抗体稀释液1中,混匀;每张玻片滴加25 μl 于杂交区域,盖上22mm×22mm盖玻片,于37℃湿盒中孵育30min;室温下4×SSC/0.1 % Tween-20中振荡洗涤5min×2缸。& @9 T( C7 ]. h
注:以上步骤按双色FISH描述,若为单色FISH则选择相应抗体即可。/ v( D' m$ k0 U4 f* O) p9 g! J
2. 核复染和抗荧光淬灭剂封片
2 _7 A4 H+ ?% {7 x! x. v1 N将1.25 μl 5 mg/ml的DAPI加入50 ml 2×SSC中(终浓度为125 ng/ml,避光保存于4℃),混匀;将玻片置于其中,避光复染2min;2×SSC中洗涤5min;梯度乙醇脱水晾干;每张玻片滴加10 μl 抗荧光淬灭剂封片,盖上22mm×22mm盖玻片,-20℃避光保存。7 F. _2 e/ l" f6 \4 m# \% {
3. 荧光显微镜检测FISH杂交信号
7 ^; a1 ^' B5 g' v以荧光显微镜观察,在DAPI/FITC/Texas Red滤光镜激发下观察中期/间期细胞的荧光杂交信号,计数细胞和采集图像。每例分析100~200个间期细胞核细胞,重叠、破损、未去除细胞质和杂交信号微弱的细胞核不计入其中。对于双色双融合FISH,细胞内杂交信号相互靠近(<1/10核直径的距离)者计为一个信号。
- u/ T A( X8 f8 e4. 储存数据& N% r+ X1 I( [' d
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