基于载体的miRNA抑制剂表达克隆方案

runsong

本人想通过慢病毒表达miRNA抑制剂，不知各位高手有何良策，不胜感激。3 ~2 y; G$ Z# D
3 _% ^# h& T3 w
注：一些公司如复能基因推出过一些产品。但我问过，一个载体两千多元，老板是不会同意的。所以我想自己构建，基本构想是基于PLL3.7，模仿miArrest™（http://www.fulengen.com/product/mirna/inhibitor/），但其中的细节我查不到资料，如果有人能给以指点，万分感激。, z7 c$ Z$ `7 ]" H; t
       本人经过一年的打拼，在慢病毒包装，小RNA方面积累了一点实验材料与经验，希望与各位战友共享。

深海寂寞鱼

  i* p/ w2 c$ C) p/ u  to runsong兄:0 t1 {) A: h* V) K0 {

. X! N, H! Q; g  建议你用miRNA sponge, 简单, 好用.8 K* D) J4 \2 G/ c5 W: S! \
8 n& g/ o: g6 g4 U
  具体的方法我就不给你啰嗦了.
7 w. N! d. T) I" H9 p) q9 i( o( P: s/ s
  直接把nature protocol给你. 里面写的非常详细." G# z1 r6 K  s) a" q1 Y: ^
2 C( J/ C8 t' A9 U; D7 |; J5 h/ Q
  而且以你的经验做起来不存在任何问题.
+ {& ^# b" R! T' ~& z" q, ~5 K; {7 g& _# u9 p" r
  你先做做看, 有什么问题继续交流.
/ V$ F2 E: h$ m
% E8 v  a  z/ X* T  看来你的实验是一步一个脚印啊.

深海寂寞鱼

! J7 ]4 Z. H/ h+ T. r, g

# r8 L9 z! E6 \- R3 |% q$ b# ONature protocol 全文:% u# \: {7 Q3 v) O
5 z  ^% V& ^% d, I$ B# w2 `7 A
MicroRNA sponges: competitive inhibitors of small RNAs in mammalian cells
; K+ X8 _: O6 I7 D- W( j. y, Q+ Q5 L4 p" i* e% O" t& n5 {

runsong

回复 深海寂寞鱼 的帖子3 x( M0 R$ G4 @2 j
1 N0 L/ x( [& J# m2 a% R) w- F8 @
谢谢大师兄

runsong

回复 深海寂寞鱼 的帖子: k$ A: M0 \, n5 N6 I) W( e

" i+ }+ e* H& d: }! x& K  i那我就把海绵加在pll3.7的U6后面。# ?7 [1 ]# G) V0 L9 }+ I  v" Q
不过还想请教一下，如何经济高效地实现海绵单元的重复？

深海寂寞鱼

回复 runsong 的帖子( b6 w2 s+ z/ [( E
! m4 a% f1 L  [+ d# `! E+ H
* [, `1 a! b$ E% G
   to runsong兄:
& u' Q% f/ A/ ^% Z2 j5 q: O# Q# F) T& A5 t
   你问问题总是会问在最最关键的地方啊.
2 N7 [% X/ R; [& u. `% p3 I7 b" U9 ^5 F
   想高效,就花钱,直接做基因合成,方便高效.省时省力.# d4 w) D8 w5 I3 T& A) J

7 h- S6 l8 M# `+ ]; n4 U   如果想经济, 就用多片段合成,然后退火连接. 稍微便宜点.  但是加上时间/人力和其他试剂,也不会太便宜.0 v8 R" }8 e  j4 C: G! |' Z- Q
& F- ?- ]  B  B  T9 D, o% T

runsong

回复 深海寂寞鱼 的帖子6 @. {( y1 `+ s( Z' C
; i' K0 U% Q, L5 N5 S( z) Q5 d
不好意思，再打扰一下。你们的海绵单元一般重复几次啊。4 T8 ^" O1 c3 S. v1 m/ N  K7 M
其实我以前一直想做海绵，就是卡在经济高效地实现海绵单元的重复这里。

sannia

这种方法还没有经验 过来学习一下

深海寂寞鱼

回复 runsong 的帖子  @7 S4 L1 d7 q  u! ^* C

1 V- i+ L2 B% I. K6 k# a' y. X
* E- k& U; E& E6 L6 C4 l* z         to runsong兄:
) ~  z2 f4 K2 L( ^' a+ `; Z
: a' |$ i/ x* R7 O5 z, K  1.  回答你5楼前半部分的问题:0 |1 \: G# M9 y$ o2 S

7 J$ e% \0 I  z       把sponge插入到U6启动子或者EGFP的后面都是可以的.; m8 t2 j) u: L) j9 I

# U+ U7 B1 O6 n! L" d       我上传的文章中也有提到.关键看你后面的目的.! d1 X# [) {: W3 V) D% ~% M( |& y
       如果放在U6的后面, 你为了终止转录还需要加上一串T . 势必会增加合成的长度.
  v* N( s% a$ G' o8 I; ~( f
" ]( D2 X0 e  y" n& \   2. 至于sponge重复几次, 这篇文章中是重复7次.
. y2 J2 A9 x- f/ H/ ]. g# J: h3 H
% p% G# o. K2 Y9 b9 c3 A       所以你先考虑做7次的重复吧.& ~8 x! Z* }* K7 M

/ B5 `  Q8 D' K3 S6 k* G( l       至于少重复几次到底会产生多大的影响, 我还没有这方面的经验.  L8 c: W/ |7 E4 m5 }( p

# G/ a$ J2 d" R, t- z3 K" U

snokey

实验室有人用合成的siRNA 来target目标miRNA的loop部分（听他说一定要cover到pre-miR中有空泡的那个部分），大概能knockdown 70%以上的活性。他没有做成病毒载体，如果把他用的miRNA序列做成病毒载体，应该效果比siRNA效果好吧。