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关于反向PCR [复制链接]

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包包
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楼主
发表于 2011-10-6 22:59 |只看该作者 |倒序浏览 |打印
最近一直在做反向PCR,P出来的总是弥散的带,不知道是引物与环化后的DNA不匹配,还是条件要改进,哪位大侠给指点一下,附上电泳图。
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沙发
发表于 2011-10-7 00:49 |只看该作者
我在反向PCR的时候,也出现过这样的情况。总是一段时间内可以P出很好的条带,但是有一段时间总是smear,也不知道是什么原因,很郁闷,只有不断换条件。我的经验是:1 感觉比较有用的方法是PCR后取少量样品跑胶,看是否是smear,如果是,那么把剩下的样品直接做PCR纯化(相当于胶回收),然后分别稀释成1:100,1:1000,1:10000等梯度,然后作为模板再次inversePCR;2 体系中加BSA;3 换酶,有时候可能Taq可以出,有时候用KOD plus吧,有时候在可以用KOD plus new,只要能出带就行;4 inversePCR很重要的是它的反应体系貌似太容易受到外界的影响了,很脆弱,稍微的改变都有可能P不出来,所以要做到:引物、dNTP、buffer等都分装成一次性的,P一次用一次,不要反复的冻融这些东西;引物一定要用两个月内的吧,不要太久;5 最后,P不出来那就把所有的东西都换新的,试试,我做的时候有一次把所有的东西都换了,结果就P不出来……唉,反正inversePCR很伤不起……有时候RP很重要,呵呵……
) Q" F  S( A& K+ n& \% ]
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藤椅
发表于 2011-10-7 00:52 |只看该作者
还想起来一点啊,你做自连环化的时候一定要16度过夜啊,用PCR仪做连接吧,哈哈,条件很苛刻……

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板凳
发表于 2011-10-7 15:17 |只看该作者
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回复 yeya 的帖子2 f) u2 O" _, d

* X. ^6 Z3 @: W/ u) w我一直以来都是在4度里连的,一般连好几天,图中这样的情况是不是可能会P出来,需要改变条件呀,谢谢了
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报纸
发表于 2011-10-7 18:32 |只看该作者
回复 军医 的帖子7 Q+ H$ @2 f; z  Y+ k* ^0 q0 E
4 X- j( ]" G" J- t  e
我以前4度连过夜,出来时smear……连好几天到没有试过……
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地板
发表于 2011-10-7 23:05 |只看该作者
回复 yeya 的帖子
: h- ~4 ~0 Z  {6 s4 b+ E0 Z& F% Z5 L& e0 M: Q, D/ ?6 j7 \4 U
那我16度连接试试,谢谢!

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7
发表于 2011-10-8 10:17 |只看该作者
,学习了

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发表于 2011-10-15 14:31 |只看该作者
回复 yeya 的帖子% Z- a3 }  Q- p, [+ g. g7 C

# a; G: S2 i- _3 D我把自连的产物转化了,但是要的菌液里提不出质粒,你遇到过没有呀?
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发表于 2011-10-16 11:58 |只看该作者
回复 军医 的帖子, G1 a9 n2 i2 R# j. _2 p2 t+ A

' P1 n, J+ M  \# d9 R我没有那样试过啊,我是从基因组上PCR出片段,然后酶切后自连,自连产物都直接PCR了啊,自连产物你可以定量看看是否正常。要是你是从基因组上P出来的片段那么提取的基因组DNA好不好也很重要。
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发表于 2011-10-16 17:37 |只看该作者
回复 yeya 的帖子
3 L; ~, `# b! j6 h4 Q5 c) C1 j# m
0 x. _6 v  @  l, |' P& E4 R我是先酶切基因组再自连成环,拿连接产物做PCR,总是P不出来,我是要检测外源基因插入到基因组的什么地方。
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