脐血来源的单个核细胞诱导CIK，细胞增殖缓慢，什么原因呢？

mengnancy

脐血来源的单个核细胞诱导CIK，细胞增殖缓慢，什么原因呢？用淋巴细胞分离液分离单个核细胞时，没有出现明显的淋巴细胞层，而是与分离液混在一起，分离液对细胞有损伤吗？

大少爷

你说“用淋巴细胞分离液分离单个核细胞时，没有出现明显的淋巴细胞层，而是与分离液混在一起”，现在的问题是你分离的是不是淋巴细胞。" G" e* H( `$ {8 [; v9 X
我们的分离方法：
, P: D  \! W: Z7 J4 F, L/ W将25 ml稀释的血标本(全血去血浆后与盐水1：2混合)缓慢加入盛有室温的15 ml人淋巴细胞分离液的50 ml无菌离心管中。离心(参数相当重要)，慢升慢降。离心完毕后，离心管内出现明显的分层，由下到上分别为：红细胞层、粒细胞层、Ficoll层、单个核细胞层和血浆生理盐水层。吸取血浆层弃之，直至距白膜层5毫米(mm)处。将红细胞层之上的所有液体转移至离心管。! j0 Z' b$ N3 [" Y/ E

8 t. B9 _7 e1 ?诱导CIK，细胞增殖缓慢，培养基的类型，添加的因子量很关键。不知你是怎么做的？/ N0 G  M0 O# Z2 t9 M+ h" S9 a
1 R( r: d% P( W# \! S' |
我们做脐血诱导的CIK细胞增值效果是非常强的，比成人外周血效果好得多。

mengnancy

感谢大少爷的回复。
5 y: E/ A: d; H$ ^* u) V我们是稀释的血标本(全血去血浆后与PBS按1：1混合)缓慢加入20ml人淋巴细胞分离液的50 ml无菌离心管中，不是室温的淋巴细胞分离液，是放置在4℃冰箱的。离心力是800g，是不是离心力太大了。离心完毕后，离心管内没有出现明显的淋巴细胞层分层，由下到上分别为：红细胞层、粒细胞层、Ficoll层、单个核细胞层和血浆生理盐水层。我也是吸取血浆层弃之，将红细胞层之上的所有液体转移至离心管。分离到的细胞是淋巴细胞，但是就是增殖比较缓慢。CIK第几天增殖的最快？培养基用的Takara的GT-T551培养基，细胞因子CD3抗体，Takara的RetroNectin，IFN-γ为1000U/ml，IL-2为300U/ml。换液是全量换还是半量换，IL-2是否要补齐？可否告知你怎么添加的细胞因子量？谢谢！2 S6 E5 j/ u: N- K

mengnancy

感谢大少爷的回复。4 y: c& ]3 q0 S* V. T
我们是稀释的血标本(全血去血浆后与PBS按1：1混合)缓慢加入20ml人淋巴细胞分离液的50 ml无菌离心管中，不是室温的淋巴细胞分离液，是放置在4℃冰箱的。离心力是800g，是不是离心力太大了。离心完毕后，离心管内没有出现明显的淋巴细胞层分层，由下到上分别为：红细胞层、粒细胞层、Ficoll层、单个核细胞层和血浆生理盐水层。我也是吸取血浆层弃之，将红细胞层之上的所有液体转移至离心管。分离到的细胞是淋巴细胞，但是就是增殖比较缓慢。CIK第几天增殖的最快？培养基用的Takara的GT-T551培养基，细胞因子CD3抗体，Takara的RetroNectin，IFN-γ为1000U/ml，IL-2为300U/ml。换液是全量换还是半量换，IL-2是否要补齐？可否告知你怎么添加的细胞因子量？谢谢！; l" A! h0 l* W

mengnancy

感谢大少爷的回复。
$ b4 F4 x7 Z; G3 X我们是稀释的血标本(全血去血浆后与PBS按1：1混合)缓慢加入20ml人淋巴细胞分离液的50 ml无菌离心管中，不是室温的淋巴细胞分离液，是放置在4℃冰箱的。离心力是800g，是不是离心力太大了。离心完毕后，离心管内没有出现明显的淋巴细胞层分层，由下到上分别为：红细胞层、粒细胞层、Ficoll层、单个核细胞层和血浆生理盐水层。我也是吸取血浆层弃之，将红细胞层之上的所有液体转移至离心管。分离到的细胞是淋巴细胞，但是就是增殖比较缓慢。CIK第几天增殖的最快？培养基用的Takara的GT-T551培养基，细胞因子CD3抗体，Takara的RetroNectin，IFN-γ为1000U/ml，IL-2为300U/ml。换液是全量换还是半量换，IL-2是否要补齐？可否告知你怎么添加的细胞因子量？谢谢！
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细胞海洋

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0 o" M, J5 ^3 f$ R+ V/ z  i3 B
- @* [# V2 i3 }3 D3 g' {- `: j感谢大少爷的回复。
8 i: o; P: p1 m我们是稀释的血标本(全血去血浆后与PBS按1：1混合)缓慢加入20ml人淋巴细胞分离液的50 ml无菌离心管中，不是室温的淋巴细胞分离液，是放置在4℃冰箱的。离心力是800g，是不是离心力太大了。离心完毕后，离心管内没有出现明显的淋巴细胞层分层，由下到上分别为：红细胞层、粒细胞层、Ficoll层、单个核细胞层和血浆生理盐水层。我也是吸取血浆层弃之，将红细胞层之上的所有液体转移至离心管。分离到的细胞是淋巴细胞，但是就是增殖比较缓慢。CIK第几天增殖的最快？培养基用的Takara的GT-T551培养基，细胞因子CD3抗体，Takara的RetroNectin，IFN-γ为1000U/ml，IL-2为300U/ml。换液是全量换还是半量换，IL-2是否要补齐？可否告知你怎么添加的细胞因子量？谢谢！
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7 C8 w) }! E8 @( B大少爷 看前面

细胞海洋

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+ x4 n3 k" X6 x( N& E9 a: e. y你回复谁 就点击对方回复帖子中的回复按钮然后输入内容 像我这样 $ }# Z$ W9 Z- K# W
否则 他会可能不到你的提问

大少爷

不知你的FICOLL是什么牌子，你可以按照说明书上的离心力和时间来离心。吸的单个核细胞层再加PBS洗涤两次，去掉一些红细胞和血小板等杂质，离心力300g左右。
. s1 `. ~, Q& n0 A$ \' G6 g用Ficoll液分离PBMC，洗涤两次，计数并用培养液调细胞浓度为 2x106/mL，当天加入1000 U/mL的IFN一γ于37℃，5% CO2悬浮培养，24 h后加入50 ng/mL的CD3McAb、100 U/mL的IL一1及1000 U/mL的IL-2，，每隔2~3d换液一次，前期细胞状态不好可以半量换液，状态好的话等量加液。第三次加液前先计数，然后按照1-2x106/mL加培养基。
4 @& D3 t+ |) ACIK一周左右时增值的是最快的。第三天或四天的时候数量会有所下降，第七天左右会急速增加。所以不要着急，先养着看看。% h$ ], l; ?& b
0 P+ N7 q5 w3 ?( R& p
前几天换液，如皋状态不好，是吸取一半培养基，离心，换新培养基重悬细胞，按照总培养基量加因子。

hwlightning

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( ]; t$ D! `9 U* E" x2 H
2 w6 }# F6 y2 A1 X* h% y请问下，你们用脐带血诱导cik，对血液除了传染病学检查还需要做哪些？

mengnancy

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# W7 W% g& S. R8 o1 l  P) E4 e( }, q
对脐带血只做了传染病学检查，包括乙肝表面抗原、丙肝抗原、梅毒和HIV。因为现在做的是预实验，所以其他的没有做了。