关于mEB的悬浮诱导的几个问题

ligangtiancai

本人近期在做小鼠iPS的体外心肌细胞诱导，分别采用的悬滴和悬浮法，现有几个问题望大家解答：
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0 n2 P9 p) N7 {! l+ G6 q8 u4 U1.直接悬浮培养EB是iPS细胞悬液的细胞密度是多少？
0 b" r2 E+ s2 u2.悬浮后多长时间换液，期间是否需要使用摇床防止EB沉降和贴壁？
: k9 r( q4 h3 W4 _. q5 T( D$ K3.悬浮后多少天可以贴壁继续培养？
; x: M5 g1 R- b4.对于后面的心肌诱导而言，悬浮法和悬滴法得到的EB差别有多大？
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6 L8 Q% h$ L* |2 m  \    谢谢！

wawj

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6 }! Q! y# g3 ?' @3 R; j! E% D
我也是做这个的。希望你有好的结果，大家可以分享经验。
4 B9 g6 O7 P0 K1.悬浮的话，细胞密度要到3*10^5.# b, S  k" d2 J) w6 ]5 C, K
2.两三天换一次液，用摇床怎么用，放到孵箱里，太麻烦了吧。用那种国产的细菌培养皿，贴壁效果较差，就还可以。
+ [" S+ z& [8 K3.一般悬浮5天后贴壁诱导分化。0 Y3 i9 C" k9 E( x
4.应该不大吧。只要形成好的ＥＢ，对后面的实验差别不大。

ligangtiancai

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' F( s! h8 X7 @) R' F很感谢你的解答，今天是悬浮后D1，看了一下，EB已经形成 ，但感觉漂浮的细胞较多，且EB都是挤在一起的，EB边缘不圆滑，有死细胞，不知这是否是正常现象？我用的密度是1.2*10^5/ml，如果需要换液的话应该怎么换？半量换液还是重悬EB沉淀后换液？谢谢！

frankieisme

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收集细胞和培养液到离心管,操作台中静止30民,EBs自然沉降下来,去上清,再加新鲜培养液继续培养.

ligangtiancai

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感谢，请问收集EB时应用什么器械收集，玻璃滴管或者1ml枪头？再就是收集到离心管中后是否需要轻轻吹打重悬，还是收集后直接等自然沉降30s？

刘森泉

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- P$ o+ e9 `3 Z, ~# @5 P8 `2 w问下你怎么将小鼠IPS转至地粘附培养皿的，我用胶原蛋白消化后，移液管刮下来放在地粘附六孔板，但团块都很小了。

ligangtiancai

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我是用0.25%胰酶消化重悬 再差速贴壁45min后吸出单iPS细胞悬液，按上面的密度直接加入到超低吸附版就行了。培养基是是20%FBS-高糖DMEM+NEAA+L-Glu

刘森泉

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+ S" Z  a; N' I; L  j8 ~0 W谢谢！消化后是用移液管刮的还是吹的呢？还是消化至整个克隆脱离？

ligangtiancai

用玻璃滴管吹打就行，可消化3分钟后吹打30~50下 然后加培养基终止后再吹打至单细胞

frankieisme

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移液管or1ml枪头都可以.