求助！EB不贴壁！

ligangtiancai

如题，我在EB诱导过程中遇到几个问题：我用1*10*5/ML的密度将iPS细胞悬浮在低粘附的6孔板中，可形成的EB周边不够圆滑，感觉像是有很多的死细胞，而且悬浮5天后转移到铺明胶的板中后几乎没有贴壁的EB。查了一下大家说可能是iPS状态和EB质量的问题，可是我的iPS状态一直都不错，呈边缘透亮的卵圆形，可形成的EB边界总是感觉不够清晰，死细胞很多（悬浮和悬滴都试过，都是一样），不知是什么原因？谢谢！

zmm

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( z" G) ^9 A) E' ]3 L& D, }6 H' v" K; o. A2 K
ips本身状态不错的话，那时不是培养EB时的液体有问题？还有就是做EB时消化时间是否太长了？

ligangtiancai

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' P* W# l7 Z: H7 ~) o' P
" O' w, y1 R6 H+ ~, T5 R培养基是高糖dmdm+20%FBS+1%NEAA+1% L-Glu  都是PAA的，之前用过10%和15%的FBS，结果也类似。iPS消化约2分钟，不知是不是消化的问题，但同一瓶中的细胞传代后生长良好

zmm

回复 ligangtiancai 的帖子# h7 P+ K' w2 H
. A6 b3 e, o  r8 O. ]# u
你这个培养基有问题吧？不加lif？培养基的成分还是挺重要的。你培养EB时可尝试用一下国产皿或者玻璃皿。

ligangtiancai

回复 zmm 的帖子, a3 n+ J- \) d5 t+ F6 n
8 m: t1 ?* f+ \
我这个是诱导分化时的培养基。培养EB我用的是corning的低粘附板，主要是在悬浮5天后需要贴壁培养时EB不贴壁

zmm

回复 ligangtiancai 的帖子' C0 u6 q2 B- z2 U' y

1 z* x- W" j6 C! ^' e+ M那你铺明胶了吗?

ligangtiancai

0.1%明胶包被30分钟

frankieisme

你可以把0.1%明胶包被时间延长到过夜or24h.还有EB接种好后最好前24h内不要动培养皿.我觉得最主要的原因可能是你EB的质量不太好的原因. 悬浮培养的时候最好每天换液,随着EB的生长,可以看到培养液变黄的程度越来越明显.

ligangtiancai

回复 frankieisme 的帖子* C, b2 B0 ]) |: H( {% w
7 S* Q6 i6 c# M- M. N
恩，我觉得你说的挺对。应该还是EB本身的质量不太好。不过我的iPS一直状态还有不错，难道问题出再EB的制作上，能告诉我一下你制作EB的详细过程么？

也行天下

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$ L, [  M  ?1 ~5 Y. c7 q' P4 ]9 X& c% U0 h# \3 H8 }% P2 L: A
我们最近用AggreWell培养板做的EB，很漂亮，在后面的培养中，贴壁也很好。