Realtime结果异常是SYBR不好么？

wuzhoulingxiao

这几次做的Realtime PCR实验，一开始用的是TAKARA公司的SYBR并以GADPH的引物实验，结果有Ct值是4或6的情况。但用了Bio-rad公司的试剂再重复就正常。如果用的是Actin B引物那不管用哪个公司的SYBR都有Ct值异常现象。请问大神是啥原因？

86964109

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0 H. O% O* h1 E
+ L9 U7 y' r. c" q4 Q' r3 h你的异常是指Ct过早吗？是不是引物的问题呀，多做几套引物的比较一下呢？或者把模板稀释下

wuzhoulingxiao

回复 86964109 的帖子' x: ]8 W  @: U6 j6 J+ ]

7 S, P* M2 f4 s' f模板正常，因为每个样都做了2个重复，一个正常，一个异常。

86964109

. h( Q4 K! S- X! g4 o" E
+ [$ T4 C( Z8 B2 O$ p3 A回复 wuzhoulingxiao 的帖子# \3 ^! I& U+ n+ j/ d

7 [- V6 r, a* \7 n- R8 w6 b你的模板是怎么加的？1μl的加还是稀释5倍后再加5μl？PCR重复性不好有可能是模板体积小，分布不均匀所致，不知道你的是不是这个原因。还有你的SYBR试剂都多久了，如果是新的应该没有太大问题才对，除非被污染了；另外仪器有校正过么？
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wuzhoulingxiao

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1 ~/ r% T+ e# R1 Q/ u1 e
" W. T, W* A) }: p% C' B) O我的模板是按经验稀释20倍的，加1ul。SYBR是新到的TAKARA的，而且新开封，没有污染。

86964109

回复 wuzhoulingxiao 的帖子0 ?% [+ w/ q, ?! Q! C/ H7 g
" S9 L" Q5 D" y$ i
我不知道这种操作对你们来说是否是已经成熟的，不过仅就我的经历来说，即使我们拿2μg质量很好RNA逆转录出来的模板，直接稀释20倍取1μl去做PCR，结果也多是很不稳定的，模板中小分子团混的是否均匀，移液器的误差等等...

sdyinong

可以尝试不稀释试一试，也需要确认是不是仪器的问题，有的孔可能有问题

lhmxm

个人觉得罗氏的染料比较好