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首先介绍一下本人自己的研究成果吧，目前能利用外周血来源PBMCs培养17天，扩增120倍，纯度（CD3-CD56+)达到70%左右。
7 z$ n1 _: z$ P' }: g$ W大致培养过程：0 p: [7 J' T) U5 S7 C; L
D0# c, h6 \% x8 F+ }
用肝素钠抗凝的采血管采集外周血，按照常规方法分离及获取自体血清灭火冷冻备用；将细胞密度调整未200万/ml。" f/ v# k8 S9 g6 U
培养瓶可以选择用单抗提前包被过夜，也可以用溶解性单抗，再加入相应的刺激因子（包括激活剂）培养。6 O. ?& Q) p( V! S
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% o v: I9 ~& Z+ q" Z对细胞进行离心换液，并将细胞转移至新的培养瓶中，此时培养液中不许添加激活剂，只需要扩增因子，将密度重新调整为200万/ml$ T6 K, _& w; n0 z
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1 C- t" N- X* c6 }$ N& i每隔两天计数并调整密度为200万/ml4 }0 J# {4 \# n- z/ Z
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* ]2 N) t% z2 m: t' v5 g* p3 i收集细胞并表型检测。
6 Z7 Z! G8 A% c; R3 ^4 U此技术取50毫升外周血培养17天能达到60亿细胞，纯度达70%左右。
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另外再分享一下开发NK工艺的经验+ [3 q$ H7 {1 P* D* C0 F5 L! g
1、查看很多文献里面都是利用IL-2和IL-15或者再添加另外的白介素类因子去培养，本人验证了非常多次都无法实现，要么数量上不去，要么纯度上不去。
3 o; C9 e' n; o$ A" K2、另外很多文献选择利用磁珠分选的方法培养，这个方法的缺陷在于分选成本高，而且纯NK扩增慢，而且分选后所得起始细胞数太少，所以最后虽然纯度达到了，但是数量还是很难满足临床需求，要是用于科研的话另当别论了。
+ ~- Z% ]2 ^; ]8 m @3、还有一个能在纯度和数量上都满足的培养工艺就是利用基因改造的K562细胞（在K562表面加入两个跨膜蛋白）做滋养细胞，培养半个月能扩增200倍的样子，但是好像这个工艺在临床上存在一定的伦理问题，毕竟滋养细胞本身就是癌变细胞，虽然在理论上是能用射线完全灭活K562，但是实际情况就不得而知了（此工艺我也做过）。
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2 h! r: U& k5 U$ l m5 `以上纯属个人在做NK培养工艺过程的一些想法。
7 O3 |+ S8 U% U& n" G7 n- i( n, [- T另外对NK培养提几点经验：. j+ E: C) M, \
1、个人觉得临床上还是用纯因子刺激的方法比较好，另外为什么只用纯粹的白介素类因子不能大量扩增，因为这些都不是很强烈的激活刺激剂，缺乏强有力的激活调动剂。这些白介素类因子在细胞活化后维持活性及扩增是没问题的，所以建议还在做优化的朋友可以考虑添加合适的刺激佐剂，具体的就不便透露了。
: `* h. X& \3 X: I0 p* z4 @$ e2、培养基的选择也比较重要，同时也不是越贵越好
0 X3 Y& [8 F0 X+ b! `7 c# A3、个人的经验来看NK的培养密度还是挺重要的，特别是接种密度，当接种密度低于200万/ml时扩增时间明显滞后，可能与个人工艺相关吧。2 v1 P5 {' y' a* K/ |1 d
4、不同品牌的因子也比较重要，因为不同品牌的效价是不一样的，建议多尝试。 |
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发表于 2015-4-29 22:16
