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1.MEF的获取：（步骤4－12已经进行实践）4 ` L( Q# Y7 {
（1）激素处理小鼠，同期发情和超数排卵
5 P' S/ e5 e9 e4 s; c+ L （2）2：1合笼过夜(雌：雄)3 m2 ~+ a: J w
（3）取出有阴道栓（即乳白色或淡黄色冻胶状物，确定其已经怀孕）的开始记时间为0.5天
6 B) `$ N4 g/ o4 D, c （4）取出妊娠12.5-14.5天的小鼠为实验材料% L$ p- o9 Z6 o- |; \/ a4 Q0 R! r
（5）颈椎脱臼法处死孕小鼠，放于盛有75%酒精的烧杯中消毒，拿到超净工作台上解剖，先剖开腹部皮肤，暴露子宫，然后换另外一套手术器械，用眼科镊提起近子宫颈端,分离子宫系膜,剪断子宫角，取出子宫，置于装有PBS的培养皿中。
6 ]: G; V0 F) u c" ?2 [* { （6）取出胎鼠，在PBS中洗涤数次。去除头、尾、内脏和四肢，仅留躯干部。在PBS中充分漂洗，弃除红细胞。(用两个镊子配合即可除去羊水膜、胎盘、头尾、内脏、四肢)（若是想培养神经干细胞，则用剪刀剪取前脑进行培养即可）（可以一起处理多个胚胎）
: B9 J5 z- a* r" X; \2 g2 { （7）在新的培养皿中加入少量PBS，放入躯干部分，用眼科剪刀剪成1mm3以下的组织块碎片（可以剪的更碎一点，下步的消化时间就可以缩短）。
9 N# n! K# C; S9 n. j3 E （8）加入2~4ml 0.25%胰蛋白酶，培养箱中消化10—15min，消化结束后加入等体积（多加点也行，只要不是少加，保证彻底的终止消化反应）的MEF Medium终止消化反应，轻轻吹打，使细胞分散。（做原代消化的时间稍长，胰酶用量也大，若是做传代，则只需加入500微升，最多1ml的胰酶，消化1~3min。）（躯干组织不易消化，做原代和传代时，故都用0.25%胰蛋白酶；而脑组织较易消化（脑肿瘤组织），原代和传代都用0.05%胰蛋白酶。）（消化可能不完全，也可室温静置5－10min，弃组织块，这样下面过滤就相对容易。）（如果消化得到的细胞太少，可以离心弃上清，PBS洗涤，重新加胰酶消化）（胰蛋白酶，Trypsin ,最适条件pH8.0，37度，溶液中钙镁离子和血清会降低其活力，故消化用的胰蛋白酶中加入了EDTA。消化结束时加入含血清的培养基即可终止反应） 6 P I# h6 m9 A& ^7 W
（ 9）将收集的细胞悬液离心，1500rpm， 4min，弃上清，加入红细胞裂解液（3~5倍体积的细胞体积），轻轻吹打1min，离心除上清，若仍有红细胞残留，则须继续进行红细胞裂解步骤。
$ U. T# u, R/ H2 v6 e# F* r- `8 X2 U （10）离心，弃上清，重悬细胞，过滤（200目筛网）并收集滤液，离心除去上清。
c' T' D5 g4 m m （11）用MEF Medium洗涤沉淀，离心除上清，重悬细胞，铺板即可。置于37度5%CO2饱和湿度培养箱中培养。（一只老鼠会有多个胚胎，得到的单细胞，可铺到三个培养皿中或者更多的培养皿中进行培养）/ k- Z$ n3 ~& a: Z* V! f. w4 @
（12）第二天换液，随后每2天换液一次。培养2～4d后，MEF接近汇合，即可按1:3比例传代培养。$ |/ Q, Y" ^ v! @# r( a
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要点: 无菌是操作关键, 动物皮毛不能直接或间接接触到子宫, 分离子宫时必须换用另一套无菌的眼科剪和眼科镊。培养同一株胚胎干细胞最好延用相同品系小鼠来源的成纤维细胞。
{5 A8 j1 D) Y% D' \要点: 仔细观察原代细胞有无被杂菌污染的迹象, 并且检测支原体, 确定无污染后传代扩增。% L2 J- j2 A& J; l, M$ s: e8 M
2.MEF传代（本步骤已经进行实践）+ E& L; g% Z9 [) u
（1）消化：吸去培养皿中的MEF Medium，用PBS洗涤1次(加5ml)后，加入1ml 0.25%Trypsin/EDTA 37度消化1min（时间可以浮动，视消化效果定，在显微镜下观察, 当少量细胞漂浮, 贴壁的细胞层出现裂隙时，即可终止反应）。
3 X' A9 E5 }. P, x! q1 ], d' R6 G（注：加PBS洗涤，是为了除去血清，否则胰酶发挥不了作用）
( ?! w% V. \! t5 _（2）终止消化：加入5ml MEF Media终止消化（此时总体积为6ml），用吸管冲洗培养面并反复吹吸，使细胞离散成为单细胞悬液。(离心步骤省略：将细胞悬液移入离心管，1500rpm×4min。弃去上清液，用MEF Media重悬MEF成单细胞悬液。)" P ^3 o6 |. W4 P0 b( _% M0 N
（3）分装接种：吸取2ml细胞悬液到新的培养皿中（其中已经加了8ml培养基），再取2ml单细胞悬液加到另外一个新的培养皿中（其中已经加了8ml培养基），此时原来的培养皿中还剩余2ml，吸取8ml培养基加入其中，轻摇，37度5%CO2饱和湿度的培养箱中培养。（1传3，其中2个是新的培养皿，1个是旧的（原先的），多省啊！ 100mm的培养皿，通常加10ml培养基）
" W" Y4 Q( J% L. `. D7 E" t; V4 H（4）隔一天，视生长状况传代。) a, G9 p/ r/ Q0 m
" c. M5 B& b, ?7 [注意: 每次传代尽量把成纤维细胞消化、吹打成单细胞悬液.
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& y8 W; g9 `! F3 v( g0 v$ w3.冻存MEF（本步骤已经进行实践）0 Z* |% ^* Z2 R. c4 u: i
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在P2传P3代时，取三分之一的dishes继续进行MEF传代操作，另外三分之二进行冻存处理（本实验中P2有27个dishes，其中8个继续做传代，成24个dishes；另外19个做冻存处理，每个dish冻存一管）。
" T* S, F/ t" ?( p7 n, ]2 x4 z7 p4 {- J（1）取出19 dishes，吸弃media，加PBS洗一次（5ml）。
/ F5 f$ ~( P8 s k（2）加1ml trypsin下消化1分钟，加2ml media 终止消化，轻轻吹打下细胞并分散均匀，收集细胞悬液到15ml离心管中（本次三个dishes收集到一个15ml离心管中），再加1mlPBS冲洗dish，并转移到离心管中。
: u a8 c) {0 E' V& D+ C（3）封口膜封口，放在离心机里，1500rpm，4度，4min，离心。与此同时，配制冻存液。取出DMSO（二甲基亚砜，作冻存剂。本实验室的DMSO是常温下保存在抽屉里的。瓶子是深色的。），喷撒酒精消毒，放在实验台上。取两支15ml的离心管，每管加9mlmedia，然后每管再加1ml DMSO，混匀。 w6 P: P0 R/ S) u1 _. i: u) o
（4）取出离心机里的离心管，喷撒酒精消毒，放在实验台上。取一管，倾倒去上清，加入3ml冻存液（因为要分装到3个冻存管中。冻存管总容量是2ml，最大刻度是1.8，本实验室通常加1ml冻存液进行保存），轻轻吹打几下，混匀细胞。取1ml，加入到冻存管中，放入冻存盒里（使用的是异丙醇冻存盒。异丙醇在冷冻细胞的过程中可以辅助实现缓慢降温，直接从室温放进-80可以达到近似于1度/分钟。异丙醇冻存盒在用之前要室温放置一段时间，让其达到室温后再用）。然后再对下一管进行操作。（应尽量避免细胞在常温下与DMSO的接触时间）' ^; ]- N. h h9 ^0 |$ w: h
（5）把冻存盒放在－80度冰箱里过夜，第二天拿到液氮中冻存。（由于液氮罐已满，所以保存暂时保存在－80度冰箱里）1 W; ~! \/ O& e! I
9 k# a; L9 l; R3 |3 y/ W B0 S 问题：一dishes太多，在消化操作时一定要快，否则第一个dish可能消化时间较长，影响细胞状态。& }7 \' R6 R5 G2 z/ a" @) J
二加1ml PBS收取余下细胞时会，由于量太少易产生很多气泡，下次要增加量到2ml 。# [6 H1 w- j" q% q. U( {
三冻存液使用的是MEF media + 10%DMSO，这样FBS含量少，对细胞状态产生影响，下次要增加FBS的含量（适当增加FBS的量有利于提高复苏时细胞的成活率）。（MEF media由DMEM 11965 +10%FBS+1%P/S）0 x0 G; f; ^) }- b/ K o
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# g& o$ u/ X0 D Z4. mitomycin C处理MEF，并冻存（本步骤已经通过实践）6 e( W5 G! }7 ~" l
（1）当P3代MEF生长接近汇合时，吸去原培养基，用PBS洗2次（每次5ml），然后加入4ml 10μg/ml的mitomycin C处理MEF细胞，置于培养箱内2h。8 E' \3 i" v7 T
（2）弃去mitomycin C，用PBS洗涤2次（每次5ml）。8 l* n3 ^ j& D0 n% V2 E
（3）加0.25％Trypsin 1ml消化1-3分钟，用2 ml MEF Media终止反应。轻轻吹打下细胞，并把悬液转移到15ml离心管中，用2ml PBS 洗涤，收集余下的细胞。（两个dishes的细胞转移至一个离心管中，总体积为5ml*2）
8 [( e* u' G a. |( j（4）1500rpm, 4度，4min，离心。与此同时配制冻存液（20ml MEF media + 2.5ml FBS + 2.5ml DMSO）。（此处相对3中冻存液，提高了FBS的含量，以期维持更好的细胞状态）5 Z# R! Y5 c6 d# A5 z! r
（5）倾倒去上清，加2ml 冻存液重悬，分装到2个冻存管中，每管1 ml。标注信息。置于异丙醇冷冻盒中，放入－80度冰箱中过夜，第二天转移到液氮罐中保存。
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. R* V b. l& O! X c3 L注：上面用的mytomicin C 可以用MEF media (DMEM应该以可以吧)配制，也可以用无菌的PBS配制。（Mytomicin C是针剂瓶装的，10mg/支，可以采用无菌PBS溶解，配制成1mg/ml，装在15ml离心管中，锡纸包裹（需要避光），4度保存即可。用时再配制成工作浓度；若是用MEF media配制，可以直接配制成工作浓度，用时直接取用。最好买sigma的。）注意丝裂霉素C 的有效期和使用方法。若发现分装的丝裂霉素C 溶液析出结晶或溶液由浅蓝色转变成紫红色时, 说明丝裂霉素C已经失效, 不能再使用。! e, M( |- x) c3 Q, \$ c
; n1 k4 G8 @0 G( Q0 x% U5.复苏（本步骤已经通过实践）" F& `3 o3 S4 I+ H2 k4 I
（1）取出冻存管，在37度水浴中迅速融化（1－2min），当有少量冰块剩余时取出，用吸水纸拭干水，用75%酒精喷一下。（剩少量冰块与完全融化，效果差别不大。也可完全融化）
3 ?) j5 t/ R! s% `3 S7 h（2）用移液枪把冻存液转移至已加有5mlMEF Media的15ml离心管中1000转，4度，4min，离心。
- a9 O! e. b2 k! O（3）2ml MEF Media 重悬，转移至加有8ml MEF Media的100mm培养皿中，于37度5%CO2饱和湿度培养箱中培养。 |
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发表于 2010-11-25 13:46
发表于 2010-11-25 14:41
