细胞复苏率很低是怎么回事啊？

冰枫de梦

年前冻存了一批C3H10T1/2细胞，过完年回来后复苏率还不到30%，怎么回事啊，愁死啦。冻存液用的是10%胎牛血清+10%DMSO+完全培养基，-4°C二十分钟，-20°C三十分钟，-70°C过夜，液氮保存。

evial

要用纯的FBS和DMSO9:1保存，你家的培养基里面有很多水，细胞当然冻裂掉啦！先-80冻一下然后放进液氮里面。你那个方法哪里看来的？

干细胞谷

细胞冷冻复苏的环节和条件比较多，而且不同的细胞冷冻过程和条件也不一样。建议你先查资料，再实验摸索。没有个七八次实验想活率达到90%以上很难。常规冷冻复苏条件掌握好，细胞活率不亚于程序降温仪冷冻。

shuixiao

我们这里冻存细胞是前一天换液，冻存液采用的90%的小牛血清+10DMSO，4℃，20min；-20℃，2h；-80℃保存。如果要放液氮的话，那就在-80摄氏度过夜，再放入液氮中。, h: k) O1 w) G* [$ h1 h. b( m/ S
复苏的过程也同样很重要，要保证尽可能快的融化。我们都是放入37℃水浴锅，并一直保持摇动，直到完全溶解。2 B, j; `. K1 v: w8 R# V2 e' s
培养过程中，可以离心收集细胞，用10%胎牛血清的完全培养基重悬后加入细胞瓶中培养；也可以用融化的冻存液加入到10%血清的培养液中培养，不过由于DMSo对细胞有毒害作用，所以必须要在24小时后换液。3 ?0 G1 t2 _6 a& {6 d8 V9 ?0 l
在胰酶消化细胞和离心重悬细胞的过程中，胰酶和吹打过程的剪切力对细胞伤害很大，所以最好不要过度消化和过度吹打！

上帝帮我转运吧

我一般都是用梯度降温仪；复苏时用37度温浴，但是不能时间长，因为温度高时DMSO对细胞的损伤很大，最好解冻到还有一点点冰晶时就停止，效果不错的。

menghy

对于楼主的冻存细胞和复苏细胞的方法个人觉得需要改进，10%FBS+10%DMSO+培养液，FBS的浓度低了，改成20％更好一些，90％的FBS我认为太浪费了没有这个必要，除非是很精贵和要求很高的细胞可以使用。在进行降温的过程中，4℃放置的时间短了，应该是２小时，之后－２０℃２小时，－８６℃过夜后放入液氮，如果有－４０℃冰箱的话可以加入这一步（２小时）。因为从你的降温时间来看，时间短了。按冻存要求是１分钟下降１度来进行的。复苏的话就是水的温度一定要在３７－３８度，反复的摇动直至溶解。7 m- U! u8 X) c3 ~% ]; V
以上只供参考，如有不对还望指出！

学无止境

回复 冰枫de梦 的帖子# l# R* i, a/ `4 k
2 G3 g( Q7 I- d
你冻细胞的方法和我差不多，唯一不同的是，在4度和-20度中放置的时间不同，我放置的时间是，分别为3个小时，之后在放入-80度中过夜，之后再移入液氮，复苏时的活力就非常好。

冰枫de梦

回复 学无止境 的帖子$ p# q! A" g+ z$ v6 _& q

) @# O& t0 h8 T! n; N( o2 l  x-20度放置时间好像不能太长吧，时间长的话好像细胞内容易形成结晶，看资料一般都两个小时以内。

lingminliang

应该是90%的FBS， -20℃应该是2小时，另外也可能与你复苏的手法和快慢有关 ，一般采用的是缓慢冻存、快速复苏

zhouxiangya

你的FBS量太少啦。我们是4度10分钟，-20度2小时，-80度过夜，液氮长期保存。